黃 妮,賈燕青,梁武龍,林 青,于三科

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院,陜西楊陵 712100)

雞柔嫩艾美耳球蟲YL株多次傳代后的致病性研究*

黃 妮,賈燕青,梁武龍,林 青,于三科*

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院,陜西楊陵 712100)

為研究多次傳代后的雞柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)YL株的致病性,分別以不同劑量的36代次柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊感染7日齡雛雞,通過臨床癥狀、死亡率、血便程度、潛隱期、盲腸病變、平均增重及每克糞便卵囊數(shù)(OPG)對其致病性進行評價。結(jié)果顯示,不同劑量孢子化卵囊感染雛雞均在感染后3 d～4 d出現(xiàn)血便,球蟲在感染雛雞體內(nèi)的潛隱期為110 h;高劑量組(1×106個/羽)、中劑量組(1×105個/羽)和低劑量組(1×104個/羽)感染雛雞較對照組的相對增重率分別是72%、74%和77%,盲腸病變記分分別是2、1.68和0.86;不同劑量感染雛雞糞便中卵囊產(chǎn)出大致呈正態(tài)分布,其中,中劑量組的卵囊產(chǎn)量均高于高劑量組與低劑量組。表明經(jīng)過多次傳代的E.tenellaYL株具有較強的致病性,且感染劑量與其致病性呈正相關(guān),卵囊產(chǎn)出呈現(xiàn)“擁擠效應”。

柔嫩艾美耳球蟲;致病性;感染劑量

*通訊作者

雞球蟲病(Coccidiosis)是由艾美耳屬(Eimeria)球蟲引起的一種以血便,在雛雞上高發(fā)病率和死亡率為特征的腸道寄生性原蟲病[1]。該病被認為是養(yǎng)禽業(yè)最嚴重的寄生蟲疾病,每年世界范圍內(nèi)給養(yǎng)禽業(yè)帶來的損失超過8.0億美元[2]。迄今,公認的病原主要是頂復器門的7種球蟲,即柔嫩、巨型、堆型、布氏、毒害、和緩和早熟艾美耳球蟲,其中柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)是毒力最強的雞球蟲之一[3]。從20世紀50年代以來,化學合成的抗球蟲藥物對于養(yǎng)雞業(yè)的快速發(fā)展起了十分重要的作用。但是,由此卻產(chǎn)生了耐藥性、藥物殘留和毒副作用等問題。因此,球蟲疫苗成為雞球蟲病更有前景的防控手段[4]。雞球蟲疫苗研制途徑之一是通過卵囊的連續(xù)傳代,縮短潛隱期,選擇早熟株,降低其毒力[5]。本文通過人工感染雛雞多次傳代的柔嫩艾美耳球蟲楊凌株(E.tenellaYL)孢子化卵囊,對其致病性進行了研究,為球蟲疫苗的研制以及雞球蟲病的防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 1日齡健康尼克紅小公雛,為楊凌華英種畜禽有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試驗蟲株 雞柔嫩艾美耳球蟲單卵囊分離技術(shù)分離純化的E.tenellaYL孢子化卵囊[6],由西北農(nóng)林科技大學獸醫(yī)寄生蟲學實驗室保存。試驗前將E.tenellaYL株經(jīng)人工感染無球蟲雞進行多次傳代,目前已獲得36代次卵囊,該卵囊置于25 g/L重鉻酸鉀溶液中29℃下孢子化,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 感染方法 試驗前檢查雛雞未感染球蟲卵囊;接雛前對飼養(yǎng)用的雞籠和所有用具嚴格消毒;在嚴格無球蟲環(huán)境下,飼喂不加任何抗球蟲藥的全價配合飼料,自由采食和飲水,飼料經(jīng)烘烤消毒,飲水經(jīng)煮沸消毒;給予24 h的光照,飼喂期間保證籠內(nèi)溫度在28℃～30℃。

7日齡時,將試驗用小公雛隨機分為4組,每組30羽。除對照組外,其余3組分別以每羽1×104個、1×105個、1×106個孢子化卵囊口服接種。接種前孢子化卵囊使用蒸餾水反復洗滌,去除重鉻酸鉀,以少許飲水送服。接種后觀察雞只的精神狀況、死亡情況、血便出現(xiàn)最早時間;測定平均增重和相對增重率;通過飽和食鹽水漂浮法,每日檢查2次卵囊,計算每克糞便中的卵囊數(shù)(oocysts per gram faeces,OPG);記錄糞便中卵囊最早排出時間,即為該感染劑量的潛隱期;感染后第10天撲殺全部存活雞,剖檢收集盲腸,并按Johnson J等[7]所述方法記錄盲腸病變記分。

1.2.2 病變指數(shù)及評判標準

1.2.2.1 盲腸病變記分 盲腸病變記分標準按5級記分:未見病變,為0分;盲腸壁散在極少數(shù)的點狀出血斑,腸壁不增厚,內(nèi)容物正常,為1分;盲腸內(nèi)容物混有少量血液,盲腸壁肥厚,可見很多出血病灶,為2分;盲腸內(nèi)大量血液或盲腸凝塊(凝血或灰白色的拴芯),盲腸壁肥厚,盲腸明顯地變形或萎縮,為3分;盲腸顯著萎縮,病變延伸至直腸,盲腸壁極度肥厚,盲腸內(nèi)容物為凝血或拴芯,為4分。算出各試驗組平均每只雛雞的病變記分平均值。

1.2.2.2 糞便記分 參考 Morehouse和 Baron(1970)標準[8],按血便程度不同劃分為5個等級:糞便正常不帶血,記0分;糞便中帶有少量血,記為1分;糞便中帶有較多量血,其他正常,記2分;糞便中帶有較多量血,其他為白色黏液或1/3是血,記3分;全部為血便或糞便中2/3的血,其他為白色黏液 ,記 4 分。

1.2.2.3 卵囊記分 采集試驗組在接種后110 h至200 h的新鮮糞便,用麥克馬斯特法計數(shù),分別計算各組雞OPG值。

2 結(jié)果

2.1 不同感染劑量的致病性結(jié)果

用1×104個/羽、1×105個/羽、1×106個/羽 3種劑量的E.tenellaYL株孢子化卵囊接種7日齡雛雞,分別對感染后雛雞存活率、最早血便出現(xiàn)時間、血便程度、潛隱期、平均病變記分、相對增重率進行檢測。由表1可見,感染劑量越大,出現(xiàn)血便的時間就越早,量也越多,病理變化越嚴重,體重增加越低,潛隱期縮短,直到感染劑量達到1×106個/羽,不再縮短。多數(shù)雞只呈現(xiàn)戰(zhàn)栗畏寒,擁擠成堆,精神萎靡,翅膀低垂,羽毛蓬松,食欲降低。第 10天,剖檢雞,盲腸多腫大,扭曲,粗細不規(guī)則,內(nèi)容物混有血液,盲腸壁有少數(shù)散在性出血,還有個別可見柱狀紅棕色腸芯。雖然未見死亡,但是試驗組增重均比對照組顯著降低(P＜0.05),各試驗組血便記分均比對照組差異顯著(P＜0.05),各試驗組較對照組病變記分差異顯著(P＜0.05)。由此可見,柔嫩艾美耳球蟲YL株的孢子化卵囊經(jīng)過多次傳代之后,致病力仍然較強。

2.2 不同感染劑量對于卵囊產(chǎn)出的影響

不同劑量感染雛雞卵囊產(chǎn)出曲線大致呈正態(tài)分布(圖1)。感染后110 h,卵囊產(chǎn)量與感染劑量呈正相關(guān);隨著感染時間持續(xù),各感染劑量雛雞排出卵囊數(shù)逐漸升高并達到最高值,且感染劑量與卵囊高峰值檢出時間呈負相關(guān);至感染后200 h,雛雞排出卵囊數(shù)降低或者檢測不到。各時間段,卵囊產(chǎn)出量多以中劑量感染組為高。

圖1 雛雞感染不同劑量E.tenella YL株后不同時間的OPG值Fig.1 OPG values at different hours after inoculation with different dosages of E.tenella YL strain

3 討論

雞球蟲病給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的危害,在臨床上,因腸道上皮的損害而導致飼料報酬的降低,雞生產(chǎn)性能的下降,體重增加緩慢甚至高水平的死亡率[9]。從本試驗可以看出,柔嫩艾美耳球蟲對雛雞的增重有很大影響,且劑量越大,對增重的影響越大。這與王仲兵等[10]研究結(jié)果相一致。柔嫩艾美耳球蟲主要侵害盲腸,并造成嚴重的病理損傷[11]。本實驗室之前相關(guān)研究表明[12],當感染劑量為1×103個/羽時,未傳代柔嫩艾美耳球蟲YL野毒株感染雛雞后,其盲腸病變記分可達到2.5～3.0,感染雛雞相對增重率減少可達17.7%。本研究結(jié)果表明,各感染劑量柔嫩艾美耳球蟲雖然對雛雞體重增重有明顯影響,但經(jīng)過多次傳代后的蟲株致病性有所減弱。Joegensen W K等[13]也報道將強毒力柔嫩艾美耳球蟲對雛雞連續(xù)感染傳代能夠獲得低毒力的疫苗候選蟲株。

球蟲感染雞后產(chǎn)出的卵囊量是球蟲的一個重要的生物學指標,但與其致病性強弱沒有必然的聯(lián)系[14]。隨著感染劑量的增加,卵囊產(chǎn)量也會逐漸增多,但當感染水平達到一定限度時,若繼續(xù)提高感染劑量,卵囊產(chǎn)量反而逐漸降低,每個卵囊的繁殖能力也會逐漸降低,潛隱期不再繼續(xù)縮短,即出現(xiàn)“擁擠效應”。擁擠效應的出現(xiàn)是由多種因素共同作用的結(jié)果,除了可供蟲體寄生的腸上皮細胞有限之外,還與宿主對寄生蟲產(chǎn)生的免疫反應有關(guān)[15]。從本研究結(jié)果看出,柔嫩艾美耳球蟲YL株感染劑量在1×106個/羽時也表現(xiàn)出明顯的“擁擠效應”。由此可見,在利用柔嫩艾美耳球蟲進行疫苗免疫效果和抗球蟲藥物的防治效果進行評價時,攻蟲劑量的選擇是至關(guān)重要的。

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Study on Pathogenicity ofEimeria tenellaYL Strain after Several Passages

HUANG Ni,JIA Yan-qing,LIANG Wu-long,LIN Qing,YU San-ke

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi,712100,China)

To study the pathogenicity of multiple passagedEimeria tenella,Seven-day-old chickenswere infected with sporulated oocysts of 36 passageEimeria tenellaYL strain at different dosages.The pathogenicity was assessed by clinical symptom,mortality,degree of bloody diarrhea,latent period,cecal lesions,average weight gain(AWG),and oocysts per gram faeces(OPG).The results revealed that the bloody stools were discharged from infected chickens at 3-4 days post-inoculation and the latent period showed to be 110 h.The relative weight gain(RWG)of high dosage group(1×106/per bird),middle dosage group(1×105/per bird)and low dosage group(1×104/per bird)were 72%,74%,77%,respectively,compared with control group.The cecal lesion scoresof high dosage,middle dosage,and low dosage were 2,1.68,and 0.86,respectively.The oocyst yields of different dosages roughly showed normal distribution.However,middle dosage group yielded the most oocysts among different treatments.Result showed thatEimeria tenellaYL strain had high pathogenicity in chickens although it was passaged for many timesand the infective dosage showed positive correlation with the pathogenicity.The oocyst output from infected chickens showed the“crowd effect” .

Eimeria tenella;pathogenicity;infective dose

S852.723

A

1007-5038(2011)09-0027-03

2011-05-18

黃 妮(1987-),女,湖北松滋人,碩士研究生,主要從事動物寄生蟲防控研究。