何 琴,焦培榮,劉大偉,韋娜娜,龔 軍,廖 明,任 濤

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動物疫病防控重點開放實驗室及廣東省動物源性人畜共患病預(yù)防與控制重點實驗室,廣東廣州 510642)

一株廣東鴿新城疫病毒的生物學(xué)特性分析*

何 琴,焦培榮*,劉大偉,韋娜娜,龔 軍,廖 明,任 濤*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動物疫病防控重點開放實驗室及廣東省動物源性人畜共患病預(yù)防與控制重點實驗室,廣東廣州 510642)

為了解廣東地區(qū)鴿新城疫病毒的生物學(xué)特性,對廣東分離株SD54進行了雞胚平均死亡時間(MDT)、6周齡雞靜脈接種的致病指數(shù)(IVPI)、1日齡雛雞腦內(nèi)接種的致病指數(shù)(ICPI)的測定,并對該毒株F基因的重要功能區(qū)片段進行RT-PCR擴增、測序,利用MEGA 4軟件繪制系統(tǒng)進化樹。經(jīng)測定,分離株SD54的MDT為 60 h、IVPI為2.49、ICPI為1.6;其F基因裂解位點的氨基酸序列為112RRQKRF117,符合NDV強毒株F基因裂解位點氨基酸序列的特征;系統(tǒng)進化樹表明該毒株屬于基因Ⅶ,與廣西鴿源株Gxp40處于同一細分支,同源性最近,表明該分離株SD54為基因Ⅶ強毒株。

鴿;新城疫病毒;基因Ⅶ型

*通訊作者

鴿新城疫俗稱鴿瘟,是由鴿I型副黏病毒(Pigeon paramyxovirus 1,PPMV-Ⅰ)引起的一種高度接觸性急性傳染病,以腸炎、嚴重腹瀉和神經(jīng)癥狀為特征,是危害養(yǎng)鴿業(yè)的重要疫病之一,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報告的疫病。PPMV-I屬于副黏病毒科(Paramy xoviridae)、禽病毒屬(Avianvirus),為單鏈負股 RNA病毒,其基因組長度約為 15 kb。PPMV-I由 NP、P 、M 、F、HN 、L 6 種病毒特異性結(jié)構(gòu)蛋白組成。有研究表明,F基因和HN基因與禽副黏病毒的變異有直接關(guān)系,使得新的基因型不斷出現(xiàn),其中F基因是決定毒力的主要基因,它所編碼的融合蛋白在病毒對細胞的穿透、溶血及細胞與細胞之間的融合方面起主要作用[1-2]。與新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)一樣,PPMV-I只有一個血清型,但是不同毒株的毒力卻表現(xiàn)出很大的差異。

該病于1981年首次在蘇丹和埃及的信鴿中發(fā)現(xiàn),隨后迅速傳播到歐洲、美國、加拿大等地[3-6],1985年傳入我國香港,同年8月珠海拱北動物檢疫局從臺灣引進的種鴿中分離到該病毒[7]。目前,我國大部分地方已有本病的報道,給我國的養(yǎng)鴿業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。本研究對廣東順德地區(qū)發(fā)病鴿群中分離到的一株鴿瘟病毒進行了致病指數(shù)測定及F基因擴增,繪制F基因的系統(tǒng)進化樹,并對F蛋白裂解位點氨基酸序列進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中使用的鴿新城疫病毒SD54株分離自廣東順德,由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染教研室及農(nóng)業(yè)部動物疫病防控重點開放實驗室分離鑒定和保存,用于分析比較的其他毒株的資料詳見表1。TRIzol、pMD18T 、RT-PCR 試劑 盒(One Step RNA PCR Kit)為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒致病指數(shù)測定 采用OIE規(guī)定的方法[8]測定其致病指數(shù),包括雞胚平均死亡時間(MDT)、1日齡雛雞腦內(nèi)接種的致病指數(shù)(ICPI)、6周齡雞靜脈接種的致病指數(shù)(IVPI)。

1.2.2 病毒F基因序列測定

1.2.2.1 設(shè)計引物 依據(jù)GenBank上公布的NDV基因序列,針對F基因核苷酸序列的保守區(qū)域運用Oligo 6.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物,擴增大小為450 bp,包含編碼F蛋白裂解位點。上下游引物為:NDV-FF:5＇-CAA AT T AGA AAA AAC ACG-3＇;NDV-FR:5＇-GCA ACC CCA AGC GC-3＇,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2.2 RNA抽提及RT-PCR 按照TaKaRa的TRIzol試劑說明書提取SD54株的病毒RNA,加入適量的DEPC處理水溶解。RT-PCR擴增參照TaKaRa的RT-PCR試劑盒(One Step RNA PCR Kit)說明書進行。

1.2.2.3 F基因序列測定和序列分析 將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后與pMD18T載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞,經(jīng)鑒定的陽性重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司進行序列測定。利用MEGA 4軟件按照文獻[9]方法選取F基因3＇末端374個核苷酸片段對SD54株與GenBank中發(fā)表的有代表性的新城疫毒株進行基因分型(表1);利用DNA Star(Version 7.1)分析其F蛋白裂解位點氨基酸序列,并對表1中的20株毒株及La Sota疫苗株進行核苷酸及氨基酸序列分析。

表1 研究所用的基因VII的毒株Table 1 Geoty pe VII of NDV isolates analyzed in this study

2 結(jié)果

2.1 病毒致病指數(shù)測定

SD54株的致病指數(shù) MDT、IVPI、ICPI分別為2.49、1.6和60,表明該毒株為新城疫強毒株。

2.2 F蛋白裂解位點的分析及推導(dǎo)氨基酸序列同源性分析

SD54株F蛋白裂解位點區(qū)(112～117)的氨基酸序列為112RRQKRF117,符合NDV強毒株F蛋白裂解位點氨基酸序列特征。將SD54株的F基因的核苷酸序列與表1中的NDV以及我國常用的La Sota疫苗株進行同源性比較,結(jié)果表明SD54株與其他基因VII毒株的核苷酸和氨基酸同源性分別為91.1%～98.1%和89.5%～97.6%,而與La Sota疫苗株的核苷酸和氨基酸的同源性只有80.1%和78.2%。

2.3 F基因進化分析

從GenBank上選擇42株NDV F基因核苷酸序列與SD54株進行系統(tǒng)進化樹繪制與分析,結(jié)果見圖1。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,本研究中的SD54株與大部分的國內(nèi)NDV均屬于基因Ⅶ型,且與CH/Gxp40/PG株處于同一細分支上,親緣關(guān)系最近(圖.1)?；颌餍偷腘DV毒株可分成三個進化分支,而與本研究分離株處于同一進化分支的有CH/ZJ1/00/GO、CH/SF/02/GO、CH/YNPA/01/CK、CH/YN-C2/CK、CH/JS-5/01/GO、CH//JS/03/GO、CH/SD5/04/GO、CH/JS/Y98/FW、CH//Gxp40/PG、CH/XJ/97/CK、CH/TW-10/06/CK、CH/TW2000/CK、CH/TW/99-173/CK。

圖1 F基因系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogeny tree of F gene

3 討論

目前,在全球范圍內(nèi)經(jīng)歷過3次NDV的大流行,而第3次大流行則是由基因Ⅵ型的鴿I型副黏病毒引起的[10-11]。20世紀90年代以來,雖然沒有出現(xiàn)世界性ND大流行,但局部地區(qū)的流行和暴發(fā)時有發(fā)生(如中國臺灣、西歐、南非、中國等地)[12-16],主要為基因Ⅶ。近年來我國鴿I型副黏病毒所包含的基因型大致有3種,即Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ型[17-19]。從系統(tǒng)進化樹上看,本研究中的SD54株與廣西株Gxp 40處于同一細分支,同源性最近,均屬于基因Ⅶ型,與近年來新城疫流行的基因型相符合。

F蛋白在NDV的致病性上發(fā)揮著重要作用。F蛋白的合成先以無活性的F0存在,F0經(jīng)蛋白酶裂解為F1和F2兩個亞單位后,發(fā)揮其融合活性,使病毒具有感染力[1]。F蛋白能否被裂解取決于F蛋白裂解位點區(qū)(112～117)處氨基酸組成和宿主細胞的特性。NDV毒力的強弱一般可以根據(jù)病毒的致病指數(shù)及F蛋白裂解位點氨基酸序列進行判斷。強毒株的F蛋白裂解位點處的氨基酸序列為112R/K-R-QR/K-R116,且117位的氨基酸為苯丙氨酸[20]。本研究中 SD54株 MDT、IVPI、ICPI分別為 60 h、2.49、1.6,且F蛋白F裂解解位點氨基酸序列為112 RRQKRF 117,兩者均符合NDV強毒判定標(biāo)準(zhǔn)。

本研究對F基因進行推導(dǎo)氨基酸序列同源性分析,發(fā)現(xiàn)SD株與基因Ⅶ其他毒株的核苷酸和氨基酸同源性均較高,但與La Sota疫苗株的核苷酸和氨基酸的同源性較低。目前尚無鴿NDV專用的疫苗,主要應(yīng)用LaSota等雞用疫苗進行免疫,這可能是免疫效果不理想的原因之一。

綜上所述,本研究中廣東分離株為基因Ⅶ型強毒株,且與La Sota疫苗株同源性較低,遺傳距離較遠。由于鴿是NDV的主要宿主及攜帶者,其活動范圍較大,是疫病傳播的一個重要隱患。因此,弄清鴿Ⅰ型副黏病毒的流行情況和遺傳進化特點,研制有效的鴿專用的鴿瘟疫苗,制定科學(xué)的防控措施,對控制該病及雞新城疫的流行具有重要意義。

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Characterization of Pigeon Newcastle Disease Virus Isolated from Guangdong

HE Qin,JIAO Pei-rong,LIU Da-wei,GONG Jun,WEI Na-na,LIAO Ming,REN Tao

(K ey Lab of Animal Disease Control and Prevention of Ministry of Agriculture,K ey Lab of Zoonoses Control and Prevention of Guangdong,College of veterinary medicine,South China Agricultural University,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

The characteristics of a pigeon Newcastle disease virus strain isolated from Guangdong were studied.Pathogenicity indexes,such as the mean death time(MDT),intravenous pathogenicity index(IVPI)and intracerebral pathogenicity index(ICPI)were 60 h,2.49 and 1.6,respectively.The important functional fragment fo F gene was amplified by reverse transcription(RT)-polymerase chain reaction(PCR)and sequenced.The motif of its cleavage site was 112RRQKRF117,which was consistent with that of velogenic strains of NDV.Phylogenetic analysis of the isolate revealed that it was clustered into genotypeⅦand has a closer relationship to pigeon NDV strain Gxp40 isolated in Guangxi.

pigeon;Newcastle disease virus;genotypeⅦ

S852.659.5

A

1007-5038(2011)09-0023-04

2011-01-17

公益性行業(yè)專項項目(200803020-08);國家自然科學(xué)基金項目(31072319)

何 琴(1986-),女,湖南衡陽人,碩士研究生,主要從事動物病毒分子生物學(xué)研究。