蘇運芳,李 義,屈延延,南志春,齊雪峰,張 涌,趙獻軍

(西北農林科技大學動物醫(yī)學院,陜西楊陵 712100)

重組溶葡球菌酶的體外抑菌活性研究*

蘇運芳,李 義,屈延延,南志春,齊雪峰,張 涌*,趙獻軍*

(西北農林科技大學動物醫(yī)學院,陜西楊陵 712100)

采用試紙片法和肉湯稀釋法測定重組溶葡球菌酶(rLspn)的抑菌圈大小、最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC),通過與溶葡球菌酶標準品和兩種抗生素相比較,評價rLspn的體外抑菌活性。試紙片法試驗結果顯示,rLspn有專一抑制金黃色葡萄球菌的作用,而對其他菌株無效;rLspn與標準品的抑菌活性差異不顯著(P＞0.05);對于耐青霉素的金黃色葡萄球菌,rLspn仍然表現(xiàn)出良好的抑菌活性。肉湯稀釋法結果表明rLspn的抑菌活性優(yōu)于對耐藥金黃色葡萄球菌最有效的鹽酸萬古霉素,MIC為0.1 μg/mL～0.2 μg/mL 。

重組溶葡球菌酶;抑菌活性

*通訊作者

溶葡球菌酶(lysostaphin)最早是由Schindler和Schuhardt從一株模仿葡萄球菌(名為模仿葡萄球菌NRRL B-2628)的培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)并分離的[1]。它是一種分子質量為27 ku的含Zn2+金屬蛋白酶,為246個氨基酸組成的單鏈分子。溶葡球菌酶具有內切肽酶活性,能夠專一水解細菌細胞壁肽聚糖gly五肽橋聯(lián)第2位與第3位gly之間肽鍵結構。而這一結構僅大量存在于葡萄球菌屬細菌中,其中又以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細胞壁中分布最廣。楊信怡等[2]研究表明,重組溶葡球菌酶(recombinant lysostaphin,rLspn)主要對金黃色葡萄球菌具有較強的殺菌活性,對甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)的抗菌效果較為突出。

溶葡球菌酶對金黃色葡萄球菌的專一溶殺作用受到了人們的重視,人們不僅利用基因組重組技術將該酶高表達于工程菌中以實現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化,而且運用到了抗病轉基因動物的研制上。金黃色葡萄球菌作為乳腺炎主要致病菌之一,人們試圖通過轉基因技術來從根本上解決這一問題,首先研制出了轉溶葡球菌酶基因小鼠[3],現(xiàn)已成功研制出轉溶葡球菌酶基因奶牛[4],且表明由奶牛乳腺上皮細胞特異性分泌出rLspn能夠有效抵抗奶牛乳房炎。

本試驗即采用試紙片法測定rLspn對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、無乳鏈球菌和多殺性巴氏桿菌的抑菌圈大小,采用肉湯稀釋法在96孔微量培養(yǎng)板上測定rLspn對敏感菌的最小抑菌濃度(minimun inhibitory concentration,MIC)和最小殺菌濃度(minimal bactericidal concentration,MBC),并通過與溶葡球菌酶標準品、鹽酸萬古霉素和青霉素相比較,研究由牛乳腺上皮細胞表達的rLspn的抑菌活性,為轉溶葡球菌酶基因奶牛臨床抗感染能力提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 致病性金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)兩株:CVCC 2258購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心,S.aureus分離株由西北農林科技大學動物醫(yī)學院免疫學實驗室提供;致病性大腸埃希菌(Escherichia coli)C83903購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心;無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)由西北農林科技大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)微生物實驗室饋贈。

1.1.2 藥品 rLspn由西北農林科技大學農業(yè)部動物生殖生理和胚胎工程重點開放實驗室提供,是通過誘導轉溶葡球菌酶基因的牛乳腺上皮細胞表達所得,為濃縮純化的細胞上清液;溶葡球菌酶(1 200 U/mg)購于上海源葉生物科技有限公司;鹽酸萬古霉素和青霉素均為Solarbio公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 MH培養(yǎng)基,為北京陸橋試劑有限公司產(chǎn)品;犢牛血清,為Gibco公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化 用接種環(huán)分別挑取菌種管中金黃色葡萄球菌CVCC 2258、金黃色葡萄球菌分離株、致病性大腸埃希菌C83903、無乳鏈球菌和多殺性巴氏桿菌少許,連續(xù)劃線法接種MH平板,37℃培養(yǎng)18 h～24 h后,挑單個菌落接種于新的MH平板培養(yǎng)12 h～16 h備用。其中無乳鏈球菌、多殺性巴氏桿菌用含20 mL/L犢牛血清的MH培養(yǎng)基。

1.2.2 rLspn、溶葡球菌酶和抗生素溶液的準備根據(jù)預實驗將rLspn用滅菌純水稀釋至50 μg/mL,溶葡球菌酶標準品做同樣稀釋;將鹽酸萬古霉素和青霉素用滅菌純水分別稀釋至 10 μg/mL和 2 μg/mL,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 試紙片法檢測rLspn的抑菌能力 用接種環(huán)挑取活化后的菌落,于生理鹽水中制成懸液作為接種物,并校正菌液濃度至0.5麥氏比濁標準(1麥氏比濁標準相當于1.5×108cfu/mL)。用無菌棉拭子蘸取校正過的菌液,在試管壁上擠壓幾次,壓去多余的菌液,涂布新鮮培養(yǎng)板表面,反復數(shù)次,每次旋轉平板60度,使整個平板涂布均勻。敞蓋室溫干燥3 min～5 min,在15 min之內用無菌鑷子將無菌濾紙片放在瓊脂表面并輕壓,使紙片與瓊脂表面完全接觸。分別滴加稀釋好的rLspn液、Lspn液、鹽酸萬古霉素和青霉素到濾紙片上,每個紙片滴加10 μL,并設立滅菌純水作為空白對照。37℃過夜孵育后觀察和記錄抑菌環(huán)大小,根據(jù)抑菌環(huán)的大小判定酶的活性。試驗平行重復3次。

1.2.4 肉湯稀釋法檢測rLspn的抑菌能力 采用96孔微量反應板,利用MH肉湯稀釋法測定rLspn的MIC和MBC。用接種環(huán)挑取活化后的菌落,于MH液體培養(yǎng)基中制成懸液作為接種物,并校正菌液濃度至0.5麥氏比濁標準。在96孔板的第1～11孔中將rL-spn與菌液體積比1∶9混合后依次進行倍比稀釋使各孔終濃度依次為 50、25、12.5、6.25、… …,0.048 828 2 μg/mL,第12孔加入100 μL 菌懸液作為空白對照;溶葡球菌酶標準品做同樣處理;鹽酸萬古霉素在各孔中的最終濃度分別為 10、5、2.5、1.25、… …、0.009 765 7 μg/mL;青霉素在各孔中的最終濃度分別為2、1、0.5、0.25、… …、0.001 953 2 μg/mL。試驗平行重復 3次。

以孔中彌散渾濁、底部有圓形或絲網(wǎng)狀沉淀為細菌生長指標,以肉眼可見細菌的最小濃度判定為溶葡球菌酶或抗生素的最小抑菌濃度(MIC)。從沒有細菌生長的最高濃度的3個孔中各取10 μL滴加到MH瓊脂平板上,每孔做3個重復,待完全吸收后,37℃培養(yǎng)18 h～24 h后菌落計數(shù),計數(shù)小于5 cfu/平板的培養(yǎng)孔濃度即為MBC[5]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件中One-Way ANOVA進行方差分析。

2 結果

2.1 試紙片法檢測rLspn的抑菌能力

由表1和圖1可以看出,rLspn對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為專一抑制作用,而對大腸埃希菌、無乳鏈球菌和巴氏桿菌均無效;金黃色葡萄球菌分離株對青霉素表現(xiàn)出耐藥,但 rLspn對其的抑制作用仍然有效,說明rLspn對金黃色葡萄球菌耐藥菌株亦表現(xiàn)為良好的抑制作用;從 rLspn對兩株金黃色葡萄球菌的作用可以得出,rLspn的抑菌活性和溶葡球菌酶標準品差異不顯著(P＞0.05),但對不同的菌株抑菌活性差異極顯著(P＜0.01)。

表1 試紙片法測定rLspn抑菌活性結果Table 1 The result of bacteriostasis activity of the rLspn by disc agar diffusion test

圖1 試紙片法檢測rLspn的抑菌活性Fig.1 T he bacteriostasis activity of rLspn by disc agar diffusion test

2.2 rLspn對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC測定

由表2可以看出,對于同一株金黃色葡萄球菌,rLspn的抗菌活性優(yōu)于鹽酸萬古霉素,且與溶葡球菌酶標準品對照相比,rLspn的抑菌活性更好,rL-spn 的最小抑菌濃度在 0.1 μg/mL ～ 0.2 μg/mL,這與文獻報道的相一致[6]。

表2 rLspn的MIC和MBC測定結果Table 2 The result of MIC and MBC of the rLspn

3 討論

隨著抗生素在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的廣泛使用,使得耐藥菌株成為威脅人畜健康的重要因素。金黃色葡萄球菌作為臨床常見菌株,對抗生素的耐藥問題越來越受到人們的重視,由此溶葡球菌酶專一溶殺葡萄球菌的高效性引起了人們的關注。殺菌試驗顯示[7],溶葡球菌酶殺菌作用迅速,且對靜止和活動期葡萄球菌均有殺滅作用,這與酶的破壁活性不受細菌生長周期影響有關。相關研究表明,溶葡球菌酶的殺菌活性呈濃度依賴性[8]。吳燕等[9]通過構建大腸埃希菌表達載體,IPTG誘導表達重組溶葡球菌酶,所得rLspn對金黃色葡萄球菌的MIC為0.003 μg/mL～0.78 μg/mL。近年來,國內外對溶葡球菌酶的研究持續(xù)不斷,上海高科生物工程有限公司研制的復合溶葡萄球菌酶(由溶葡萄球菌酶和溶菌酶復配而成)已形成獸藥產(chǎn)品應用于臨床治療,現(xiàn)又有“重組溶葡萄球菌酶粉”即將上市,用于治療奶牛子宮內膜炎和乳房炎。為避免耐溶葡球菌酶菌株的出現(xiàn),聯(lián)合其他抗菌物質的使用成為了一項課題,溶葡球菌酶與抗菌肽(茶樹油[10]、噬菌體裂解酶Lysk[11]和抗菌肽ranalexin[12])的聯(lián)合使用已有報道,Desbois A P等[13]最新研究表明,溶葡球菌酶與牛乳鐵傳遞蛋白、乳酸鏈球菌素、黏菌素,達托霉素和多黏菌素B聯(lián)合使用有協(xié)同抗菌作用。

本研究結果證明rLspn有專一抑制金黃色葡萄球菌的作用,且與溶葡球菌酶標準品和抗生素相比,rLspn無論對金黃色葡萄球菌標準株還是分離菌均有良好的抗菌活性,極低濃度(0.1 μg/mL～0.2 μg/mL)即可有效抵抗金黃色葡萄球菌。Wall R J等[4]報道僅3 μg/mL的溶葡球菌酶已能夠抵抗葡萄球菌性乳房炎,因此,轉基因牛乳腺上皮細胞分泌的rLspn可有效抵抗金黃色葡萄球菌的感染。隨著轉基因技術的發(fā)展,轉rLspn基因奶牛的研制成功雖然在一定程度上能夠解決奶牛乳房炎問題,但對于含有rLspn牛乳的食品安全還需要進一步的評估。此外,現(xiàn)今報道的溶葡球菌酶應用于臨床治療多為外用或注射給藥,口服溶葡球菌酶的藥代動力學研究是必要的。

[1]Schindler C A,Schuhardt V T.Lysostaphin:a new bacteriolytic agent for theStaphy lococcus[J].Proc Natl Acad Sci USA,1964,51(3):414-421.

[2]楊信怡,游雪甫,婁人慧,等.重組溶葡球菌酶的體外抗菌活性研究[J].中國新藥雜志,2006,15(24):2107-2111.

[3]Kerr D E,Plaut K,Bramley A J,et al.Lysostaphin ex pression in mammary glands confers protection against staphylococcal infection in transgenic mice[J].Nat Biotechnol,2001,19:66-70.

[4]Wall R J,Powell A M,Paape M J,et al.Genetically enhanced cows resist intramammaryStaphylocaccus aureusinfection[J].Nat Biotechnol,2005,23(4):445-451.

[5]王以光.抗生素多學科研究入門[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1998:18.

[6]楊信怡,游雪甫,蔣建東.溶葡球菌酶研究進展[J].中國生化藥物雜志,2005,26(6):372-374.

[7]Walsh S,Kokai-Kun J,Shah A,et al.Extended nasal residence time of lysostaphin and an anti-staphylococcal monoclonal antibody by delivery in semisolid or polymeric carriers[J].Pharmaceutic Res,2004,21(10)∶1770-1775.

[8]楊信怡.重組溶葡球菌酶抗菌藥效學及耐藥機制研究[D].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學研究生院,2005.

[9]吳 燕,伍素華,羅向東,等.重組溶葡萄球菌蛋白的原核表達、純化及生物學活性研究[J].第三軍醫(yī)大學學報.2007,29(11),1060-1062.

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[11]Becker S C,Foster-Frey J,Donovan D M.The phage K lytic enzyme Ly sK and ly sostaphin act synergistically to kill M RSA[J].Fems Microbiol Lett,2008,287(2):185-191.

[12]Desbois A P,Gemmell C G,Coote P J.In vivoefficacy of the antimicrobial peptide ranalexin in combination with the endopeptidase lysostaphin against wound and sy stemic meticillinresistantStaphylococcus aureus(M RSA)infections[J].Int J Antimicrob Agents,2010,35(6):559-565.

[13]Desbois A P,Coote P J.Bactericidal synergy of lysostaphin in combination with antimicrobial peptides[J].Eur J Clin Microbiol,2011.DOI 10.1007/s10096-011-1188-z.

In vitroBacteriostasis Activity of Recombinant Lysostaphin

SU Yun-fang,LI Yi,QU Yan-yan,NAN Zhi-chun,QI Xue-feng,ZHANG Yong,ZHAO Xian-jun

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi,712100,China)

The size of inhibition zone,the minimun inhibitory concentration(MIC)and the minimal bactericidal concentration(MBC)of the recombinant lysostaphin rLspn were assessed by disc agar diffusion test and broth dilution test,through comparing with lysostaphin and two kinds of antibiotics,to appraise the bacteriostasis activity of recombinant lysostaphinin vitro.Disc agar diffusion test showed that rLspn suppressedStaphylococcusspecificallx,but was invalid to other strains.T he bacteriostasis activity of rLspn and Lspn was not significant difference(P＜0.05).Regarding theStaphylococcusresisting to penicillin,rLspn still showed good bacteriostasis activity.Broth dilution test indicated that the bacteriostasis activity of the rLspn was higher than that of hydrochloric acid vancomycin,which was effective to antibiotic resistenceStaphylococcus,and the MIC was 0.1 μg/mL-0.2 μg/mL.

recombinant lysostaphin;bacteriostasis activity

S852.79

A

1007-5038(2011)09-0019-04

2011-04-20

國家重大課題“抗病轉基因牛新品種培育”(2008ZX08007-004)

蘇運芳(1985-),女,河南蘭考人,碩士研究生,主要從事臨床獸醫(yī)學研究。