郭寶平,石保新,張壯志,吐爾洪?依米提,古努爾?吐爾遜,哈斯也提?艾力,王進成,劉 斌,張文寶*,丁曉玲,阿不都

(1.新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所,新疆烏魯木齊 830000;2.新疆疾病預防控制中心,新疆烏魯木齊 830011;3.新疆實驗動物研究中心,新疆烏魯木齊 830002;4.烏魯木齊市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,烏魯木齊 830000)

EgM9免疫犬引起細胞因子表達的變化規(guī)律研究

郭寶平1,2,石保新1,張壯志1,吐爾洪?依米提1,古努爾?吐爾遜1,哈斯也提?艾力1,王進成1,劉 斌3,張文寶1*,丁曉玲4,阿不都4

(1.新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所,新疆烏魯木齊 830000;2.新疆疾病預防控制中心,新疆烏魯木齊 830011;3.新疆實驗動物研究中心,新疆烏魯木齊 830002;4.烏魯木齊市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,烏魯木齊 830000)

用重組表達蛋白EgM9免疫犬,通過實時定量PCR方法檢測IFN-γ和IL-4表達的變化規(guī)律。用 Trizol試劑提取新鮮全血的總 RNA,取0.5 μg總RNA,采用實時定量PCR法逆轉錄擴增 IFN-γ、IL-4和內參基因G3PDH,擴增產物經電泳分離后,用凝膠圖像分析儀照相和掃描分析,檢測其相對表達量。IFN-γ、IL-4和G3PDH分別在202、316、282 bp處出現明顯條帶,與GenBank查閱的基因條帶大小基本一致;0、6、10、15周表達量依次升高,在15周時最高,IFN-γ尤為明顯,它的變化始終大于 IL-4。EgM9免疫犬后,能激起犬體內很強的細胞免疫和體液免疫反應,而且細胞免疫處主導地位。實時定量PCR方法為犬感染細粒棘球絳蟲及其他疾病的早期診斷和流行病學調查提供了初步依據。

EgM9;免疫機理;細胞免疫;體液免疫;犬

*通訊作者

近年來對T輔助細胞1(Th1)和T輔助細胞2(Th2)的研究取得令人矚目的進展,Th1和Th2能反映動物體內免疫的變化規(guī)律[1-3]。真核生物的寄生蟲非常復雜,免疫系統(tǒng)很難將其從宿主體內清除出去,因此針對許多寄生蟲的免疫反應可能非常強而且是持續(xù)的,并常常是固定在某一特定的調節(jié)狀態(tài)在寄生蟲感染的免疫應答過程中,輔助性T細胞(Th細胞)處于核心位置,決定免疫特異性及發(fā)生何種免疫應答。體液免疫與細胞免疫的交互調節(jié)主要在于Th亞群間的調節(jié),Th1細胞通過分泌IL-2 IFN-γ和TNF-β促進細胞免疫。Th2細胞通過分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 及 IL-13 促 進體 液免疫[4]。本試驗用重組表達蛋白EgM9免疫犬,通過實時實時定量PCR方法檢測IFN-γ和IL-4表達的變化規(guī)律,探索EgM9免疫犬后引起的免疫機理。本實驗應用定量逆轉錄聚合酶鏈反應,檢測免疫犬及攻擊原頭節(jié)后細胞因子IFN-γ及IL-4的mRNA的表達水平,并且利用 3-磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH)引物作為標準參照基因,獲得了比較好的結果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用犬 利用自繁的犬,飼養(yǎng)在隔離室中,8只犬/組,共16只。在試驗前,檢測了每只犬的生理狀況,并注射了犬用五聯(lián)疫苗后觀察,用吡喹酮(5 mg/kg)驅蟲,利用McMaster slid的方法收集3 g糞便,檢查是否帶有細粒棘球絳蟲蟲卵。

1.1.2 主要試劑和儀器 T rizol為BBI公司產品,反轉錄試劑盒、IReal Time PCR試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產品,Agarose為SeaKem公司產品,MOPS為 Sigma公司產品,DNA Ladder Marker為 T rans Biotech公司產品;Real-Time PCR儀為Bio-Rad公司的iQ5型號,RNA定量儀為Eppendroff公司產品,凝膠成像儀為Bio-Rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1 編組及免疫劑量 設一個EgM9免疫組及一個谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase,GST)融合蛋白對照組,8只犬/組,免疫組犬號為1376、1377、1380、1388、1389,對照組犬號為 1378,1381,1383,1384,1390,1391(由于QuilA毒性比較大,其剩余的幾只犬在免疫試驗初期死亡)分頸部皮下和后腿肌肉兩點注射,EgM9組的犬注射等體積的EgM9和佐劑QuilA的混合物,GST組犬注射等體積的GST和佐劑QuilA的混合物,每只犬免疫接種100 μg蛋白及5 mg QuilA,兩組的注射量和注射部位相同。

1.2.2 佐劑及免疫程序 佐劑為QuilA(batch№L77-129b Superfos biosector Denmark),共免疫 3次,一免和二免間隔期 3周,二免和三免間隔期2周。在三次免疫后的2周后(第7周),經口感染原頭節(jié)(protoscoleces PSCs)200 000枚,感染 45 d后剖檢犬,并統(tǒng)計荷蟲量。

1.2.3 血清的處理 自試驗開始0周起每2周定期采血,4 000 r/min離心15 min,離心后收集血清,-20℃待用

1.2.4 引物的設計與合成 根據在基因庫(EMBL/GenBank)中細胞因子的序列,設計了犬的細胞因子的擴增引物,如下:IFN-γ(S41201,202bp):上游引物5′-CAT TCAAAGGAGCATGGATACC-3′,下 游引 物 5′-GACTCCTT TTCCGCITCCTI′AG-3′;IL-4(AF054833,316 bp):上游引物 5′-CCTCCCAACTGATTCCAACTC-3′,下游引物上游引物5′-GATT TCAT TCATAGAACAGGTC-3′,3-磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH,AF054608,282 bp)引物作為標準參照基因,其上游引物5′-GTGATGCTGGTGCTGAGTATG-3′,下游 引物 5′-GTGATGGCATGGACTGTGG-3′。

1.2.5 總 RNA的提取 采集的新鮮血液加入到含有檸檬酸鈉的抗凝管中,離心提取中間的白細胞,并用PBS和雙蒸水洗滌,5 000 r/min離心5 min,液氮中保存。從液氮中取出裝有白細胞的1.5 mL離心管,加入1 mL的 Trizol提取總RNA,其他步驟參照說明書操作。測定的樣品在260 nm和280 nm的吸收值確定RNA的含量和純度。

1.2.6 甲醛變性瓊脂糖電泳 處理好的電泳槽內加入大約300 mL的1×FA Gel buffer;提取好的RNA中加入 1×FA Running buffer,65℃溫育3 min～5 min,冰上冷卻,加入1/5體積 5×RNA Loading buffer,再上樣平衡好FA Gel;電泳條件:在1×FA Running buffer中以5 V/cm2～7 V/cm2恒壓電泳,每0.5 min用tip頭吸取兩極的電極液,使之混勻,以避免電泳過程中產生的堿性梯度降解RNA。一般在冰上電泳,小膠板50 V～60 V,約1 h;電泳后,在凝膠成像儀中觀察并拍照。

1.2.7 RT-PCR反應條件 42℃反轉錄反應15 min;95℃反應2 min使反轉錄酶失活。2 μL 5 ×ExScriptTMRTase buffer,0.5 μL dNTP Mixture(各 10 mmol/L),0.5 μL Oligo dT Primer(50 mmol/L),0.25 μL ExScriptTMRTase(200 U/μL),0.25 μL RTase Inhibitor(40 U/μL),XμL Total RNA(模板為 200 ng),加 RTase Free H2O至 10 μL,反應體系共 10 μL 。

1.2.8 Real-time PCR反應條件 95℃10 s;95℃預變性5 s,60℃中退火延伸34 s,共40個循環(huán)。具體加樣如下:10μL SYBR Premix ExTaqTM(2 ×),2 μL(20 μ mol/L)PCR Forward Primer,2 μL(20 μ mol/L)PCR Reverse Primer,2 μL 模板,0.4 μL Rox,加ddH2O(滅菌蒸餾水)至20 μL,反應體系共 20 μL 。

1.2.9 PCR擴增產物的電泳 處理好的電泳槽內加入大約300 mL的1×DNA Gel buffer;取擴增好的PCR反應液5 μL,加入1/5體積5×DNA Loading buffer混合后上樣;電泳條件為1×DNA Running buffer中以5 V/cm2～7 V/cm2恒壓電泳,小膠板50 V～60 V,約35 min;電泳后,在凝膠成像儀中成像并拍照。

2 結果

2.1 RNA提取結果

運用定量方法檢測特異基因表達量,應用Tri zol試劑盒提取細胞總RNA,并且做甲醛變性膠電泳分析總RNA是否完整及降解。從圖1可以看到提取的0周的RNA完整,純度高,3條帶都比較清楚完整。

2.2 實時定量PCR瓊脂糖凝膠結果

2.2.1 IL-4擴增結果 從圖2(A為0周、B為15周時的血樣)結果中我們可以看到,擴增的IL-4片段比較清楚,IL-4位置在316 bp,和GenBank所查閱的基因相似,擴增的片段是目的片段。

2.2.2 IFN-γ的擴增結果 從圖3結果可以看出,擴增的15周血樣的IFN-γ片段比較模糊,IFN-γ位置基本在202 bp,和GenBank所查閱的基因相似,擴增的片段是目的片段。

2.2.3 15周血樣中IFN-γ、IL-4和內參基因的擴增結果 從圖4中可以看出,IL-4和G 3PDH擴增的條帶比較明顯,其中IL-4與圖2擴增的條帶大小一致,而IFN-γ則與圖3擴增的條帶基本相似,但是比較模糊。

圖1 RNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 The ex tracted RNA by agaragar electrophoresis

圖2 IL-4的PCR擴增結果Fig.2 The IL-4 gene amplified by PCR

圖3 IFN-γ的PCR擴增結果Fig.3 The IFN-γgene amplified by PCR

圖 4 第15周的IFN-γ,IL-4和內參基因PCR擴增結果Fig.4 The IFN-γ,IL-4 and reference gene amplified by PCR in 15th week

2.3 實時定量PCR測定的0周和15周的Ct結果

從表1可以看出,每次的讀數值基本一致,差異不顯著 ,但是 IFN-γ、IL-4 、G3PDH 相比 較,大小依次為 IL-4、IFN-γ、G3PDH,說明在細胞的表達過程中,IFN-γ的表達量高于IL-4。

2.4 實時定量PCR結果

把0周的IFN-γ和IL-4當成一個單位即 1,可以得出它們在 0、6、10、15周增長的倍數(圖 5);也可以把0周IFN-γ和IL-4當成一個單位即1,相應的它們在0、6、10、15周增長的倍數也就是2的n次冪即增長指數(圖6)。

表1 Real-time PCR測定0周和15周血樣的CtTable 1 The Ctdetermined by real-time PCR in 0 and 15th week samples

圖5 增長倍數分析結果Fig.5 The analysis result of increase multiple

圖6 增長指數分析結果Fig.6 The analysis result of power multiple

3 討論

實時定量方法具有靈敏度高、特異性強、可對大量樣本同時進行分析的優(yōu)點。實時定量方法擴增特異性片段時所用的染料是SYBR GreenⅠ,這是最經濟的方法,但需要優(yōu)化PCR反應,使引物不形成聚合體。這是SYBR GreenⅠ染料不能分辨真正模板和人工模帶,不像TaqMan探針和分子指標。在PCR反應體系中,加入過量的SYBR GreenⅠ熒光染料,SYBR熒光染料特異性地摻入到DNA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。

在應用定量方法檢測特異基因表達量的差異時,總RNA的質量至關重要,只有在總RNA 未被降解的情況下,才能保證其中mRNA的完整性,從而真實反映起始模板中基因表達量的差異。本試驗采用此方法提取的RNA含量和純度都比較高,與文獻[4]報道相符。同時在進行逆轉錄之前,總RNA的定量也是試驗的關鍵步驟,在本研究中逆轉錄時,所有的樣本都使用0.5 μg總RNA作為起始模板,從而保證了隨后的PCR擴增條帶亮度的差異,能夠真實反映基因表達的實際情況。作為內參基因的G3PDH基因屬保守性強,在細胞內表達恒定,G3PDH的mRNA具有普遍而恒定表達的特性,設立內參照可減少因加樣造成的誤差或RNA定量時產生的誤差。

從擴增的犬IL-4(圖2)中可以比較清楚的看到,IL-4擴增的片段清晰,比擴增的 IFN-γ清楚,造成IFN-γ擴增不清晰且有雜帶的可能是由于做 PCR前我們設計的引物特異性不高,容易產生雜帶;另一個原因可能是做PCR時退火和延伸的溫度低,影響DNA的延伸;也可能是在操作的過程中的污染而造成一些雜帶的形成,以及瓊脂糖沒有充分溶解后倒膠。

從結果看,IFN-γ表達水平是0周的1 000倍以上,IL-4也有將近20倍的增加,說明其誘導細胞Th1和Th2顯著上升,能誘發(fā)很強的細胞免疫和體液免疫,而且能產生很好的免疫保護效果。Th1還可通過分泌IFN-γ誘導抗體產生,本試驗的抗體水平上升與之有一定的關聯(lián)。IFN-γ基因表達過程中mRNA的合成遠優(yōu)先于分泌的蛋白,用實時定量PCR方法檢測其mRNA表達水平可以衡量起始表達產物的水平,對臨床早期診斷有一定的參考價值[7]。IL-4可單獨維持Th2的增殖,IL-4通過其受體的信號轉導,對Th2細胞活化、分化、增殖及抗凋亡等各種效應都起了十分重要的作用[5-6]。而Th2通過IL-4、IL-6和IL-10促進B細胞分泌IgE抗體,使得IgE水平上升,IgE與肥大細胞和嗜堿粒細胞的高親和力的受體結合而使機體處于致敏狀態(tài),當局部增加IgE時,可能有利于抑制蟲體發(fā)育,即機體的特異性免疫防御機制[8]。另外,Th2可介導機體的體液反應,與抗蠕蟲感染有關,促進機體抗體水平的上升;本試驗中,IL-4有明顯的升高,與之相符。

剖檢試驗犬并統(tǒng)計其荷蟲量,免疫組和對照組差異比較顯著,相對于對照組,免疫組的驅蟲可達到86%以上,取得了很好的保護效果;與之相應的是免疫組和對照組的IFN-γ和 IL-4差異也比較顯著。首先,很可能由于IL-4大量上升使 Th2升高,促進了B細胞分泌抗體,如:主要抗體IgG及其亞類在免疫組和對照組之間抗體存在顯著的差異;這些抗體作用于蟲體,使之不能在腸道內存活,同時促進了犬腸道的排蟲,以致免疫組中的荷蟲量相對于對照組的荷蟲量有顯著的降低。另外,Th1還可通過分泌IFN-γ也能誘導抗體產生,進一步促進了抗體的分泌,使免疫組和對照組的抗體水平進一步拉大,導致了荷蟲量有明顯的差距,最后,EgM9有望成為一種有效的疫苗候選基因用于包蟲病的防控。

皂苷(QuilA)是一種表面活性劑,可導致紅細胞溶解,但在低劑量時卻具有佐劑活性,用于多數獸醫(yī)病毒、細菌和寄生蟲疫苗。QuilA又是ISCOMS佐劑的主要組成部分[9],ISCOMS已廣泛用于人及獸用疫苗的佐劑,它能激起機體的 Th1和 Th2反應[10],在免疫中起到非常重要的作用,在本實驗中QuilA起到了非常重要的作用,而且QuilA也可單獨作為佐劑用于動物的免疫[13]。

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Expression Levels of INF-γand IL-4 in Dogs Vaccinated withEchinococcus granulosusAdult Specific Protein EgM9

GUO Bao-ping1,2,SHI Bao-xin1,ZHANG Zhuang-zhi1,T URGUN Yimit1,GULINUL Turson1,
HASYET Ali1,WANG Jin-cheng1,LIU Bin3,ZHANG Wen-bao1,DING Xing-ling4,Abdul4

(1.Veterinary Research Institute,Xinjiang Academy of Animal Science,Urumqi,Xinj iang,830000,China;2.Xinjiang Central for Disease Control and Prevention,Urumqi,Xinjiang,830011,China;
3.The Laboratory Animal Central of Xinjiang,Urumqi,830002,China;
4.Urumqi Animal Inspection Institute,Urumqi,Xinjiang,830000,China)

Our previous studies showed that EgM9 was specifically expressed in the adult stage ofEchinococcus granulosusand induced protection in dogs against the parasite infection in terms of suppression of egg production and segmentation.To understand the mechanisms underlined the protection,we used normal RT-PCR and quantative real-time PCR to measure the expression levels of two cytokines,INF-γand IL-4 in dogs after vaccinated with recombinant EgM9.The result showed that the vaccination induced a predominant cytokine INF-γexpression in dogs from beginning to the end.Whereas,IL-4 was in low level in 10 weeks after vaccination and then elevated.We conclude that EgM9 predominantly induced a Th1-type immune response which is likely associated with dog protection againstE.granulosusinfection.

EgM9;immune mechanism;cellular;humoral immunity;dog

S852.4

A

1007-5038(2011)09-0013-06

2010-02-24

美國NIH(美國國立醫(yī)學科學院)項目

郭寶平(1979-),男,陜西人,碩士研究生,主要從事預防獸醫(yī)學研究。