焦寒偉,杜 麗,雷 明,張冬琳,郝永昌,張曉茹,匡文華,成 鷹,王鳳陽*

(1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院,海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌),海口市動物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南海口 570228;2.華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北武漢 430079)

水牛MD-2 cDNA基因的克隆與原核表達(dá)

焦寒偉1,杜 麗1,雷 明1,張冬琳1,郝永昌1,張曉茹2,匡文華2,成 鷹1,王鳳陽1*

(1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院,海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌),?？谑袆游锘蚬こ讨攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南?？?570228;2.華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北武漢 430079)

為探討水牛抵抗革蘭陰性菌感染的免疫機(jī)制,克隆、表達(dá)了水牛髓樣分化蛋白-2(bMD-2)基因,并用Western blot進(jìn)行鑒定。采用RT-PCR方法從水牛外周血白細(xì)胞中擴(kuò)增bMD-2基因,構(gòu)建pET28abMD-2表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21(DE3)中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。結(jié)果顯示,bMD-2基因含有一個483 bp的開放閱讀框,編碼161個氨基酸;37℃條件下,經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h后,His-bMD-2在E.coliBL21中表達(dá)量最高,并以包涵體的形式存在,融合蛋白的分子質(zhì)量約為25 ku。結(jié)果表明水牛MD-2原核表達(dá)載體成功構(gòu)建并表達(dá),為繼續(xù)深入對水牛MD-2基因功能的研究提供參考。

水牛;MD-2;克隆;原核表達(dá)

*通訊作者

MD-2是結(jié)合在Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)胞外區(qū)的一種髓樣分化蛋白[1-2],它和TLR4組成的復(fù)合體(MD-2/TLR4)能識別細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、纖維粘連蛋白、熱休克蛋白和紫杉醇等的配體,進(jìn)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[3-4]。髓樣分化蛋白-2(myeloid differentiation-2,MD-2)還是天然免疫中的調(diào)控分子,在炎癥、感染、免疫等病理過程中發(fā)揮極為廣泛的生物學(xué)功能[5-7]。

水牛(Bubalus bubalus)廣泛分布于中國南方,在生產(chǎn)中具有重要的經(jīng)濟(jì)價值(勞役、產(chǎn)奶和產(chǎn)肉)。目前,對MD-2的研究主要集中在黃牛和小鼠,已發(fā)現(xiàn)多種全身炎性反應(yīng)性疾病的發(fā)生與MD-2參與的信號通路相關(guān),但國內(nèi)外對水牛MD-2基因的研究尚未有相關(guān)報(bào)道。本文通過對水牛MD-2基因的克隆表達(dá),為繼續(xù)對MD-2功能的研究提供參考,對提高我國水?？辜?xì)菌性疾病能力具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

水牛血液采自海南本地興隆水牛。原核表達(dá)載體pET28a為上海捷瑞生物工程有限公司產(chǎn)品;膠回收試劑盒、TaKaRa RNA iso Reagent、PMD20-T Vector試劑盒為寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品;血液總RNA提取試劑盒為上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品;小量質(zhì)粒提取試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品;小鼠抗His單克隆抗體為Merck公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為Invitrogen公司產(chǎn)品;ECM顯色試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品;Ni2+-NTA Superflow為QIAGEN公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。大腸埃希菌(E.coli)DH5α和BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物 根據(jù)已知MD-2序列設(shè)計(jì)兩對特異性引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,引物序列如下:

Forward:5＇-AACATGTT TCCAT TTCTGC-3＇,Reverse:5＇-CTAATTGAAATCAGGGTAATGTATG-3＇;

P1:5＇-GTGTGAATTCATGTT TCCAT TTCTGCTT-3＇,P2:5＇-GGCTAAGCT TATTGAAATCAGGGTAATG-3＇。

下劃線處分別表示添加的EcoRⅠ和HindⅢ限制性酶切位點(diǎn)。

1.2.2 水牛外周血白細(xì)胞總RNA的提取 參照申明霞的方法提取總RNA[1]。

1.2.3 RT-PCR 以 1.5 μL總 RNA(含量約 1 μg)為模板,按試劑盒說明書利用 Revert AidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈,以F、R為引物進(jìn)行降落PCR。反應(yīng)條件為:94℃3 min;94℃30 s,66℃30 s,72℃1 min,每個循環(huán)退火溫度降低1℃,當(dāng)其降至44℃時;以94℃30 s,44℃30 s,72℃1 min進(jìn)行28個循環(huán);最后,72℃后延伸5 min。反應(yīng)完成后,用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,回收目的條帶。TA克隆后,經(jīng)菌落PCR并提取質(zhì)粒酶切鑒定后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序,將此重組質(zhì)粒命名為PMD20-bMD-2。

1.2.4 序列生物信息學(xué)分析 利用測序結(jié)果,采用DNAMAN軟件分析其核酸及其所編碼蛋白的生物學(xué)特征。

1.2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-bMD-2的構(gòu)建 以構(gòu)建好的PMD20-bMD-2為模板,P1、P2為引物擴(kuò)增bMD-2編碼區(qū),在T4 DNA聚合酶的作用下,將回收的經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切的PCR產(chǎn)物及經(jīng)同樣酶處理的pET-28a載體,在16℃條件下,過夜連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,涂板,挑選陽性克隆,提取質(zhì)粒,酶切鑒定后測序。

1.2.6 pET28a-bMD-2的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析將含陽性重組質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物于37℃培養(yǎng),當(dāng)OD600nm=0.6～0.8時,加入IPTG至終濃度為0.01 mmol/L～5 mmol/L,誘導(dǎo)6 h后取樣,進(jìn)行SDS-PAGE篩選出的最佳誘導(dǎo)濃度;以最佳濃度分別誘導(dǎo) 1、2、4、6 h后取樣 ,用 120 g/L 的變性膠進(jìn)行SDS-PAGE,確定最佳誘導(dǎo)時間。以最佳誘導(dǎo)時間、濃度的IPTG誘導(dǎo)10 mL菌液,離心經(jīng)超聲波裂解,分別取上清和沉淀,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,對重組蛋白進(jìn)行可溶性分析。

1.2.7 融合蛋白的Western blot 經(jīng)SDS-PAGE電泳后,將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。用 50 g/L脫脂牛奶TBST(含0.5 mL/L Tween 20)室溫封閉2 h,TBST洗滌5次,一抗為抗His×6單克隆抗體(1∶1 000);二抗為辣根過氧化氫酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG-H RP(1:2 000),DAB顯色,至目的條帶染色清晰時終止顯色。

2 結(jié)果

2.1 pET28a-bMD-2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒PMD20-bMD-2為模板,P1、P2為引物,擴(kuò)增整個編碼區(qū),得到約483 bp的特異性片段。將該片段用EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切處理后克隆入同樣酶切處理的 pET28a載體,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,提取質(zhì)粒用EcoRⅠ/HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定,得到約5 000 bp與483 bp的條帶(圖1)。說明bMD-2已成功連入pET28a載體中,測序進(jìn)一步確定讀碼框架正確,將該重組質(zhì)粒命名為pET28a-bMD-2。

2.2 bMD-2生物信息學(xué)分析

將測序所得水牛MD-2的核酸序列利用DNAMAN軟件進(jìn)行分析(圖 2),并與黃牛(AB_072456)、豬(NM_001104956)、兔(NM_001082787)和小鼠(NM_001159711)、和的核酸序列進(jìn)行同源性比對,結(jié)果表明水牛MD-2與黃牛、豬、兔和小鼠MD-2核酸序列的同源性分別為98.76%、81.99%、78.88%和67.91%,氨基酸同源性分別為97.50%、71.25%、66.25%和58.75%。

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Enzyme digestion analysis results of recombinant plasmid

2.3 融合蛋白的表達(dá)與條件的優(yōu)化

DNAMAN軟件分析結(jié)果顯示,CDS區(qū)編碼蛋白為19 ku,融合蛋白的前后加上His標(biāo)簽而使分子質(zhì)量達(dá)到 25 ku左右。37℃條件下,0.01 mmol/L～5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h后結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)IPTG濃度為1 mmol/L,目的蛋白的表達(dá)量最高(圖 3);1 mmol/L IPTG 分別誘導(dǎo) 1 、2、4、6 h,蛋白表達(dá)量增多(圖4);表達(dá)菌經(jīng)過超聲波破碎處理,取上清和沉淀分別電泳,發(fā)現(xiàn)目的蛋白以包涵體形式存在(圖5)。

2.4 融合蛋白的Western blot

融合蛋白進(jìn)行Western blot。TBST洗膜后進(jìn)行DAB顯色,在分子質(zhì)量約25 ku處有一特異的條帶,說明目的蛋白成功表達(dá)(圖6)。

圖2 bMD-2 CDS序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 bMD-2 CDS sequence and deduced amino acid sequence

圖3 不同濃度IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of induced protein under different IPTG concentrations

圖4 不同時間誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of induced protein at different time

圖5 重組蛋白可溶性分析Fig.5 Solubility analysis of recombine protein

圖 6 重組蛋白western blot鑒定Fig.6 Western blot analy sis of the recombinant protein

3 討論

MD-2、TLR4以及白細(xì)胞分化抗原14(cluster of differentiation antigen14,CD14)三者通常組成復(fù)合物受體識別LPS,完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。復(fù)合物結(jié)構(gòu)的完整性是其發(fā)揮功能的基礎(chǔ),其中,MD-2能與TLR4胞外區(qū)結(jié)合,使其對LPS更敏感,從而增強(qiáng)其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)強(qiáng)度[9-10]。

LPS在內(nèi)毒素結(jié)合蛋白(LPS binding protein,LBP)的參與下,主要作用于膜結(jié)合型CD14(membrane CD14,mCD14),再通過一系列信號通路引起細(xì)胞的活化或損傷[11-13];而MD-2在大多數(shù)情況下是與TLR4、CD14形成復(fù)合物后才能識別LPS。

研究表明,LPS可以迅速上調(diào)肝臟組織中TLR4/MD-2的基因表達(dá)并誘導(dǎo) TNF-α的表達(dá),因此,MD-2的功能研究對治療肝臟相關(guān)疾病具有重大意義[14];此外,MD-2功能的研究對于治療膿毒癥也具有重要意義[15-16]。為了深入研究水牛MD-2在感染、免疫、炎癥等過程中的重要作用,我們構(gòu)建了原核表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)了His-MD-2的融合表達(dá),不但為MD-2相關(guān)研究做必要的準(zhǔn)備,還將為從細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的角度研究與水牛MD-2相關(guān)疾病作鋪墊。

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Cloning and Prokaryotic Expession of MD-2 from Buffalo

JIAO Han-wei1,DU Li1,LEI Ming1,ZHANG Dong-lin1,HAO Yong-chang1,ZHANG Xiao-ru2,KUANG Wen-hua2,CHENG Ying1,WANG Feng-yang1

(1.College of Agriculture,Hainan University,Hainan K ey Lab of Tropical Animal Reproduction&Breeding and Epidemic Disease Research(Construction Period),Animal Genetic Engineering Key Lab of Haikou,Haikou,Hainan,570228,China;2College of Li fe Sciences,Huazhong Normal University,Wuhan,Hubei,430079,China)

This study was designed to clone and express buffalo myeloid differentiation-2,and then carry out Western blot for it.RT-PCR was used to clone CDS area of buffalo MD-2,and the PCR products of bMD-2 were cloned into pET-28a,and transformed intoE.coliBL21.The bioinformatics analyses were performed.The protein expression was induced by IPTG and analyzed by SDS-PAGE and Western blot.The results showed that the bMD-2 CDS contain a 483 bp ORF,which encodes 161 amino acids,and His-bMD-2 fusion protein was expressed inE.coliBL21(DE3)with molecular weight of 25 ku induced at 37℃,6 h by 1 mmol/L IPTG,which indicated that prokaryotic expression vector of buffalo MD-2 was constructed and expressed successfully.

buffalo;MD-2;cloning;prokaryotic expression

Q785

A

1007-5038(2011)09-0009-05

2011-05-06

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2009ZX08007-009B)

焦寒偉(1987-),男,重慶彭水人,碩士研究生,主要從事動物功能基因組學(xué)研究。