王文秀,呂素芳,朱 輝,管 宇,魏 鳳,唐 娜,沈志強,*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600;2.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州 256600)

兩株豬圓環(huán)病毒2型的分離及基因組序列分析*

王文秀1,呂素芳1,朱 輝2,管 宇1,魏 鳳1,唐 娜1,沈志強1,2*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600;2.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州 256600)

為比較豬圓環(huán)病毒2型毒株的遺傳變異特性,從2009年河南鄭州和山東東營的豬場疑似豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合征(PMMS)病料中分離到2株病毒,經(jīng)PCR檢測初步鑒定為豬圓環(huán)病毒2型,并對病毒全基因組進行擴增,用DNA Star對序列進行比較分析。結(jié)果表明,分離到的河南鄭州和山東東營PCV-2毒株全基因組長度均為1 767 bp,與國內(nèi)外參考毒株核苷酸同源性為93.5%～99.6%,兩毒株之間核苷酸同源性為95.9%,與PCV-1分離株核苷酸同源性為68.9%～69.3%。本研究中來自兩個不同省份的2株P(guān)CV-2毒株均屬于基因型PCV-2b,且兩個PCV-2分離毒株在進化方面存在地域差異。

豬圓環(huán)病毒2型;分離;基因組;序列分析

*通訊作者

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)最早被視為一種細胞污染物,由 Tischer I等于 1974年在PK-15細胞系中首次發(fā)現(xiàn)[1-2]。1982年,Tischer I等用超速離心法提取病毒粒子,并用外切核酸酶S1鑒定核酸類型,用電鏡觀察核酸狀態(tài),首次揭示了豬圓環(huán)病毒是一種單鏈環(huán)狀DNA病毒,并將其被命名為豬圓環(huán)病毒。豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)為豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原,1991年在加拿大首次被證實,隨后在美洲、歐洲的許多國家和亞洲的一些國家和地區(qū)均有報道[3-5]。PCV-2又是引起豬的繁殖障礙、皮炎與腎病綜合征和幼齡豬的先天性震顫等的重要致病因子[6],已成為影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病病原之一。近年來,對PCV-2遺傳變異情況的報道不斷增多,PCV-2基因組多為1 767 bp或1 768 bp,而Dupont K等報道了基因組為1 766 bp的新病毒株[7-10]。為了解PCV-2流行毒株的遺傳變異特性,本研究對2009年豬場分離到的2株P(guān)CV-2進行了全基因測定以及序列分析,為開展疫病流行病學(xué)、相關(guān)免疫學(xué)、遺傳進化和疫病防控等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料與細胞 病料分別來自河南鄭州、山東東營PMWS仔豬肺、脾和淋巴結(jié),分別命名為HN01株、DY01株,無PCV-1和PCV-2污染的PK-15細胞由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所宋長緒研究員饋贈。

1.1.2 主要試劑、質(zhì)粒與菌種 rTaq酶、dNTPs、DNA Marker、pMD 18-T Vector、Hind Ⅲ、BamHⅠ內(nèi)切酶、蛋白酶K、氨芐青霉素等均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;DNA膠純化回收試劑盒為百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,宿主菌DH5α由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院重點實驗室保存;D-氨基葡萄糖為美國Alfa Aesar公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中發(fā)表的PCV-2基因序列(登錄號為FJ544563),設(shè)計一對特異性引物:上游引物 P1:5′-GAACCGCGGGCTGGCTGAACT TT TGAAAGT-3′,下游引物 P2:5′-GCACCGCGGAAAT TTCTGACAAACGT TACA-3′, 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,上下游引物均含有SacⅡ酶切位點。

1.2.2 病料的PCR檢測 取疑似PMMS病料充分研磨制成懸液,反復(fù)凍融3次,離心取上清200 μL,加入蛋白酶K至終濃度1 mg/L,加入終濃度為100 g/L的SDS,55℃水浴2 h,用苯酚-氯仿抽提,吸取水相加入1/10體積的3 mol/L的NaAc及2倍體積的無水乙醇沉淀1 h,于 4℃條件下 12 000 r/min離心 10 min,加超純水懸浮沉淀,取 2 μL做PCR模板。

1.2.3 PCR擴增 采用引物對提取的DNA進行擴增,按照下列反應(yīng)條件和循環(huán)參數(shù)進行:95℃變性5 min;94℃1 min,58℃1 min,72℃3 min,35個循環(huán),72℃延伸10 min,最后4℃保存。

1.2.4 PCR擴增產(chǎn)物的克隆與酶切鑒定 PCR

產(chǎn)物在8 g/L瓊脂糖電泳后,切下含有目的條帶的瓊脂塊,用DNA膠純化回收試劑盒回收凝膠中的DNA 。取 5 μL 膠回收產(chǎn)物與1 μL pMD 18-T Vector和4 μL SolutionⅠ在 16℃下連接過夜;按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。挑取白色菌落接種LB液體培養(yǎng)基,37℃震搖過夜。以堿裂解法小量堤取質(zhì)粒。用HindⅢ、BamHⅠ內(nèi)切酶雙酶切鑒定重組質(zhì)粒。

1.2.5 測序鑒定與分析 將鑒定陽性質(zhì)粒送至上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。應(yīng)用DNA Star軟件將獲得的2個PCV-2毒株全基因序列及ORF1和ORF2基因序列分別與GenBank中登錄的其他序列進行同源性比較分析,并對糖基化位點進行分析

1.2.6 病毒的培養(yǎng)增殖 將組織病料加入1 mL的PBS研磨勻漿,凍融3次,12 000 r/min離心5 min,取上清以0.22 μ m的細菌濾器過濾,加入青霉素(100單位/mL)與鏈霉素(100 mg/L),4℃作用過夜后與無PCV污染的PK-15細胞進行同步接種,培養(yǎng)1 d后棄上清,用300 mmol/L D-氨基葡萄糖于37℃處理30 min后棄去上清,用D-Hanks洗滌3遍,加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收獲病毒。以此法繼續(xù)盲傳15代,每3代提取接毒細胞的DNA模板,PCR檢測。

2 結(jié)果

2.1 樣品PCR檢測結(jié)果

河南鄭州和山東東營豬場的疑似PMWS仔豬病料PCR檢測均擴增出約1 800 bp的目的片段(圖1),與預(yù)期大小相符。將檢測陽性的病料處理液接種到無PCV污染的PK-15,盲傳3代后PCR檢測仍為陽性,繼續(xù)傳代,每3代檢測1次,直至第10代結(jié)果均為陽性。

2.2 測序、同源性比較及序列分析

用DNA Star軟件對序列進行拼接和分析表明,分離到兩株病毒全基因長度均為 1 767 bp,DY01毒株和HN01毒株的ORF2長度分別為702 bp和705 bp,且已錄入GenBank,登錄號分別為HM030908和GU574204。

全基因核苷酸同源性分析表明:本次分離毒株(HN01和DY毒株)與GenBank中的PCV-2參考毒株序列中同源性為93.5%～99.6%,與PCV-1(NC001792和 GU371908)毒株序列的同源性為68.9%～69.3%,HN01和DY01毒株相比較發(fā)現(xiàn),HN01與其他毒株同源性相對較低,為 93.5%～95.9%,與東營毒株(DY01)同源性為95.9%,與北京毒株(EU921255、GQ449669-SD-09)同源性為95.9%和95.8%;與湖南毒株(FJ716704)、江蘇毒株(FJ644559)同源性分別為95.4%和95.6%;與法國毒株(AY322002)、斯洛伐克毒株(EU545551)和中國臺灣毒株(AF166528)同源性為95%～95.8%;與澳大利亞毒株(AY424401)、加拿大毒株(AF086834)、希臘毒株(DQ915586)和韓國毒株(FJ905471)同源性為93.5%～94.7%;其中國外毒株中,HN01株與法國和斯洛伐克毒株同源性相對較高,達95.8%和95.6%。而DY01毒株與其他毒株同源性相對較高,為94.8%～99.6%,同國外毒株同源性分析發(fā)現(xiàn),與法國和斯洛伐克毒株同源性較高,分別為為98.6%和98.4%。本次分離的兩個毒株HN01和DY毒株與國內(nèi)外毒株同源性比較發(fā)現(xiàn),HN01和DY毒株均與北京毒株(EU921255)同源性最高,分別為95.9%和99.6%,而與國外毒株同源性最高的均為法國和斯洛伐克毒株。此外,HN01和DY01毒株與兩株P(guān)CV-1(美國毒株和天津毒株)同源性僅為68.9%～69.3%(圖2)。

圖1 PCV-2基因擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of the PCR products of PCV-2 gene

將分離的HN01和DY01株的ORF1和ORF2核苷酸與其他毒株進行比較(表1和表2),結(jié)果分離株DY01的ORF1和ORF2與其他毒株均具有較高的同源性,與其他毒株 ORF1的同源性分別為97.5%～99.8%,與PCV-1 ORF1也具有較高同源性,為82.9%;與其他毒株ORF2的同源性為92%～99.6%,與 PCV-1 ORF2同源性為 68.2%;而HN01株的ORF1與其他毒株同源性為89.9%～94.2%,ORF2與其他毒株同源性為 89.9%～94.2%,與PCV-1的ORF1同源性為67.9%。兩分離株之間的ORF1同源性為97.2%,ORF2同源性為94.2%。

進化樹分析表明,PCV分為 PCV-1和PCV-2兩大分支,PCV-2又大致分為2個亞分支,國外毒株(除歐洲外)和Taiwan毒株均位于a分支,而國內(nèi)分離毒株與歐洲分離毒株均位于b分支,本次分離毒株與國內(nèi)分離毒株親緣關(guān)系較近,均屬于b分支,DY毒株與北京分離毒株親緣關(guān)系最近(圖3)。

圖2 分離毒株全基因核苷酸同源性分析Fig.2 Nucleotide homology comparison of genome DY01 and HN01 strains with other strains

表1 PCV-2 HN和DY株與其他PCV的ORF1核苷酸同源性比較Table 1 Nucleotide homology comparison of ORF1 among PCV-2 HN01,DY01 strain and the other strains

表2 PCV-2 HN和DY株與其他PCV的ORF2核苷酸同源性比較Table 2 Nucleotide homology comparison of ORF2 among PCV-2 HN01,DY01 strain and the other strains

圖3 PCV-2分離株的系統(tǒng)發(fā)生進化樹Fig.3 Phylogenic tree of PCV-2 isolates DY01 and HN01

3 討論

PCV-2是引起PMWS的主要病因,對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。臨床上出現(xiàn)的PMWS病例多為PRRSV、PPV等與PCV-2混合感染所致。諸多研究報道PCV-2基因序列在進化上比較保守,但引起的疾病卻廣泛多樣,隨著時間的推移,也逐漸發(fā)生了變異。

目前,有些學(xué)者根據(jù)鏈長度和ORF2內(nèi)的特殊標記性結(jié)構(gòu)將PCV-2分為兩個主要亞型,即PCV-2a型和PCV-2b型。PCV-2a型和PCV-2b型序列相似性約95%;兩種亞型的主要區(qū)別在ORF2基因,其核酸序列及肽序列的相似性約90%,含有特殊標記性結(jié)構(gòu)PCV-2b型標記性結(jié)構(gòu)為TCAAACCCCCG,PCV-2a型的標記性結(jié)構(gòu)為ACCAACAAAAT很容易進行區(qū)分。另一個區(qū)別是 PCV-2b全長1 767 bp,而PCV-2a全長 1 768 bp[9,11]。有學(xué)者對 PCV-2a和PCV-2b群的毒力進行研究,結(jié)果表明兩個亞群毒力沒有明顯差異[12]。然而也有調(diào)查研究顯示PCV-2b群可引起豬PMWS,而PCV-2a多為帶毒而不引起發(fā)病[13]。經(jīng)過對國內(nèi)外PCV-2分子流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn),PCV-2基因型發(fā)生了由PCV-2a到PCV-2b的轉(zhuǎn)換,以PCV-2b流行毒株為主[14]。

本研究2009年從來自河南鄭州和山東東營疑似PMWS病料分離到2株P(guān)CV-2,通過PCR擴增獲得了兩株病毒株的全基因序列。經(jīng)序列分析表明,分離的兩株病毒株均屬于基因型PCV-2b,且與國內(nèi)外參考毒株核苷酸同源性為93.5%～99.6%,兩毒株之間核苷酸同源性為95.9%,與PCV-1分離株核苷酸同源性為68.9%～69.3%。河南毒株HN01與參考序列同源性相對較低,為93.5%～95.9%,而山東分離毒株DY01與參考序列同源性較高,為94.8%～99.6%,親緣性較近。兩個分離毒株與國外毒株同源性比較發(fā)現(xiàn),分離株與法國和斯洛伐克較其他國家毒株具有更高的同源性,表明他們可能來源于同一個祖先。

HN01毒株的ORF2基因含有705個核苷酸,而大多數(shù)PCV-2毒株的ORF2為702個核苷酸。從進化樹中可看出,HN01在b分支中又自成獨立的一支,與參考毒株親緣關(guān)系較遠;從序列同源性分析結(jié)果來看,HN01毒株全基因序列與參考序列同源性相對較低,其ORF2基因序列也與其他毒株存在較大差異。將分離毒株與參考毒株ORF2的氨基酸進行糖基化位點分析發(fā)現(xiàn),DY01株與參考毒株均在131或132位有一個潛在的糖基化位點,而HN01毒株無糖基化位點,推測該毒株在進化過程中發(fā)生變異,導(dǎo)致潛在糖基化位點的缺失。ORF2基因是主要的結(jié)構(gòu)蛋白基因,編碼病毒的衣殼蛋白,是主要的免疫原性蛋白,該基因序列出現(xiàn)較大差異及糖基化位點的缺失提示,PCV-2毒株在進化過程中已經(jīng)開始出現(xiàn)一定程度的變異,變異的發(fā)生是否會影響到抗原表位的抗原性或病毒的毒力,尚有待于進一步研究。

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Isolation and Genomic Sequence Analysis of Two PCV-2

WANG Wen-xiu1,L¨U Su-fang1,ZHU Hui2,GUAN Yu1,WEI Feng1,TANG Na1,SHEN Zhi-qiang1,2

(1.Shandong Binzhou Animal Science&Veterinary Medicine Institute,Binzhou,Shandong,256600,China;2.Shandong Lvdu Bio-Sciences&Technology Co.Ltd,Binzhou,Shandong,256600,China)

Two porcine circovirus type 2(PCV-2),strains DY01 and HN01 were isolated from highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus-infected samples.The PCV-2 isolates were identified by PCR method.The complete genomes of these PCV-2 isolates were sequenced and their molecular variations analyzed using DNAStar software.Comparison analysis of the complete genomic sequences of two PCV-2 isolates indicated that they were closely related to each other(95.9%)and to other PCV-2 strains in GenBank(93.5%-99.6%).There was 68.9%to 69.3%sequence identity among PCV-2 and PCV-1 isolate genes.Phylogenetic analysis revealed that the two isolates belonged to genotype PCV-2b.This two PCV-2 strains isolated from Henan and Shandong provinces were both belong to PCV-2b type,and this two PCV-2 strains have area lvariation on gene evolution.

Porcine circovirus type 2;isolation;genome;sequence analysis

S852.659.2

A

1007-5038(2011)09-0005-05

2011-05-11

山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化重大專項計劃(2008ZHZX1A1103)

王文秀(1978-),女,新疆伊寧人,博士,助理研究員,主要從事分子病原學(xué)與細胞生物學(xué)研究。