祝長青,唐泰山,王 婷,蔣 原,姚火春,張常印,薛 峰,欒 軍

(1.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局,江蘇南京 210001;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇南京 210095;3.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河南洛陽 471003)

空腸彎曲菌peb1A基因的克隆表達(dá)及免疫原性分析*

祝長青1,2,唐泰山1,2,王 婷3,蔣 原1,姚火春2*,張常印1,薛 峰1,欒 軍1

(1.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局,江蘇南京 210001;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇南京 210095;3.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河南洛陽 471003)

根據(jù)空腸彎曲菌基因序列設(shè)計(jì)引物,以菌株ATCC 29428為模板擴(kuò)增出peb1A基因片段,定向克隆至pMD18-T載體中,并對(duì)克隆片段測(cè)序,比較所測(cè)序列與不同來源彎曲菌的同源性;用軟件改造并合成peb1A基因78 bp～780 bp區(qū)間片段,PCR擴(kuò)增后,構(gòu)建出表達(dá)載體pET-28a(+)-peb1Ag,轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)后誘導(dǎo)表達(dá),純化后獲得重組蛋白PEB1;將其進(jìn)行Western blot分析、小鼠免疫試驗(yàn)。結(jié)果表明,克隆的peb1A基因序列與報(bào)道的NCTC 11168核苷酸同源性為98.1%,改造表達(dá)后的重組蛋白PEB1具有良好的抗原性和免疫原性,免疫小鼠后血清效價(jià)達(dá)1∶12 800,為空腸彎曲菌保護(hù)性抗原的研究和單克隆抗體的篩選奠定了基礎(chǔ)。

空腸彎曲菌;peb1A;原核表達(dá);免疫原性

*通訊作者

空腸彎曲菌(Campylobacter jej uni)是一種在世界范圍廣泛流行的常見人畜共患病原菌,不但大量存在于各種野生或家養(yǎng)動(dòng)物的腸道內(nèi)引起多種畜禽疾病,還能導(dǎo)致人類食源性疾病和格林-巴利綜合癥。在世界各國細(xì)菌性食物中毒中,由于空腸彎曲菌所導(dǎo)致的食物中毒常居前列,世界衛(wèi)生組織(WHO)已將該病列為最常見、最重要的食源性疾病。在英國、美國等發(fā)達(dá)國家由空腸彎曲菌所導(dǎo)致的腹瀉病例超過了沙門菌而列為首位[1]?？漳c彎曲菌的抗原結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,具有廣泛的抗原多樣性或差異性,目前已知有近60個(gè)血清型,且還有增加的趨勢(shì)?？漳c彎曲菌的菌體外膜上的抗原成分主要為蛋白質(zhì)和脂多糖(O抗原)及鞭毛(H抗原)[2]。黏附蛋白PEB1是營養(yǎng)素ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一個(gè)主要接合成分,存在于所有空腸彎曲菌的表面,由peb1A基因編碼,在各個(gè)菌株中具有相對(duì)的保守性。大量研究表明PEB1直接參與空腸彎曲菌的黏附入侵過程,在致病過程中起著至關(guān)重要的作用,是該菌侵襲腸道的重要致病因子。PEB1在空腸彎曲菌感染時(shí)可產(chǎn)生一定程度的免疫力,在大約80%的空腸彎曲菌感染病人恢復(fù)期可檢測(cè)到抗PEB1抗體。在動(dòng)物模型中,PEB1的A位點(diǎn)加強(qiáng)空腸彎曲菌對(duì)腸上皮細(xì)胞大腸埃希菌的黏附和侵襲,并促進(jìn)了定植;而滅活PEB1的A位點(diǎn)則能夠顯著地削弱空腸彎曲菌的黏附力[3]。從空腸彎曲菌菌體中直接提取蛋白純品較為困難和繁雜,在實(shí)際工作中難以被應(yīng)用,而基因工程技術(shù)則為此提供了有利途徑。本試驗(yàn)根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的NCTC 11168(Pen2血清型)[4]的基因序列,對(duì)peb1A基因進(jìn)行了克隆、改造、表達(dá),并分析了表達(dá)蛋白的免疫原性。

1材料與方法

1.1 材料

空腸彎曲菌 ATCC 29428、大腸埃希菌BL21(DE3)、pET-28a(+),由本課題組保存;CR系小鼠購自南京軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,約10周齡,體重25 g～30 g;pMD18-T載體為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品,異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)和弗氏完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品;His Bind純化試劑盒為Novagen公司產(chǎn)品;引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 peb1A基因的PCR擴(kuò)增、克隆和分析 根據(jù)GenBank公布的空腸彎曲菌NCTC 11168(Pen2血清型)中peb1A基因序列,設(shè)計(jì)上游引物:5＇-AT-GGTT TT TAGAAAATCT TTG-3＇,下 游 引 物:5＇-TTATA AACCCCAT-TT TT TCG-3＇,擴(kuò)增片段長度為780 bp。

擴(kuò)增參數(shù)為:94℃預(yù)變性5 min;94℃30s,55℃60 s,72℃60s,共40個(gè)循環(huán);72℃最終延伸7 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后,回收目的條帶,連接到pMD18-T載體。參照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行制備DH 5α感受態(tài)細(xì)胞,連接物轉(zhuǎn)化后篩選到陽性質(zhì)粒pMD18-T-peb1A,用PCR和EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切方法鑒定后送寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。用 DNA Star軟件將測(cè)序結(jié)果與 NCTC 11168及其他已知彎曲菌的peb1A基因序列進(jìn)行同源性比較分析。

1.2.2 peb1A基因的改造和擴(kuò)增 由于空腸彎曲菌peb1A的(G+C)%含量低(31.5%),且與原核表達(dá)體系E.coli密碼子兼并性較差,根據(jù) NCTC 11168的基因序列和測(cè)序結(jié)果,利用Vector NTI軟件對(duì)peb1A基因78 bp～780 bp區(qū)間片段進(jìn)行改造,改造后peb1Ag基因組與原基因組的基因同源性為76.5%,(G+C)%含量為48.7%,氨基酸序列不變,委托寶生物工程(大連)公司合成。根據(jù)改造的peb1Ag基因序列,設(shè)計(jì)出上游引物:5＇-GGATCCATGGT TT TTAGAAA-3＇, 下 游 引 物 :5＇-CGCCAT TATAAACCCCAT T-3＇,擴(kuò)增片段大小為708 bp。采用50 μL反應(yīng)體系:10×反應(yīng)緩沖液5μL,25 mmol/L MgCl21μL,20 μ mol/L 的引物各 1 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1 μL,Taq酶 0.3 μL,DNA 模板 2 μL,用ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。PCR 循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性5 min,94℃60 s,58℃60 s,72℃60 s,40個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。

1.2.3 peb1A重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳后,目的條帶回收后EcoR I和BamH I雙酶切,與重組載體pET-28a(+)連接。轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中,篩選到陽性表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-peb1Ag,用PCR 和EcoR I和BamH I雙酶切方法鑒定,并送寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。

1.2.4 重組蛋白的表達(dá)和純化 含pET28a(+)-peb1Ag的E.coliBL21(DE3)于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期(A600 nm為0.6～0.8),加入IPTG至1 mmol/L,誘導(dǎo)4 h后離心,菌體沉淀用PBS溶液重懸,超聲裂解后離心,沉淀用6 mol/L尿素溶液溶解,離心,上清用 0.45 μ m 微孔濾膜過濾后,用 His Bind純化試劑盒純化重組蛋白。分別收集誘導(dǎo)前后菌液、超聲裂解離心后的上清和沉淀以及His柱純化的蛋白,用120 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)電泳分析。

1.2.5 Western blot His柱純化的重組蛋白經(jīng)120 g/L SDS-PAGE電泳后,凝膠用伯樂半干轉(zhuǎn)印儀電轉(zhuǎn)印至PVNF膜。將轉(zhuǎn)印后的PVNF膜用10 mL/L牛血清白蛋白封閉,加入1∶100稀釋的鼠抗空腸彎曲菌陽性血清,37℃作用1.5 h后洗膜;加入1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶(H RP)標(biāo)記的兔抗鼠IgG,37℃作用1 h后洗膜;用3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色 5 min。

1.2.6 小鼠免疫試驗(yàn) 純化的重組蛋白PEB1用PBS溶液稀釋至400 μg/mL,加入等量的弗氏完全佐劑乳化,背部皮下皮下注射ICR系小鼠,0.2 mL/只,共10只,每2周加強(qiáng)免疫 1次,共加強(qiáng)免疫2次,設(shè)立E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-peb1 Ag未誘導(dǎo)滅活全菌免疫作為對(duì)照。二次免疫后,每周采血分離血清,間接ELASA檢測(cè)外周血中相應(yīng)抗體的效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 peb1A基因的克隆和分析

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD18-T-peb 1A經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ進(jìn)行雙酶切,以及PCR擴(kuò)增出現(xiàn)780 bp大小的片段(圖1),得到的ATCC 29428的peb1A基因序列并登錄于GenBank上,登錄號(hào)為EU753356。

圖1 pMD18-T-peb1A重組質(zhì)粒的鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pM D18-T-peb1A

應(yīng)用DNA Star軟件,將空腸彎曲菌 ATCC 29428與GenBank中其他空腸彎曲菌株的peb1A基因進(jìn)行比較,推導(dǎo)出peb1A基因編碼的蛋白質(zhì)有260個(gè)氨基酸,與NCTC 11168菌株基因同源性為98.1%,氨基酸同源性為99.7%,與其他空腸彎曲菌的基因同源性為98.1%～ 99.9%(圖2),說明peb1A基因在空腸彎曲菌中比較保守。

圖2 空腸彎曲菌株ATCC 29428與其他空腸彎曲菌株的peb1A基因進(jìn)化關(guān)系Fig.2 The peb1A gene relationship of C jejuniA TCC 29428 and other strains

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-peb1Ag分別進(jìn)行酶切和PCR擴(kuò)增后,電泳可見708bp特異性條帶(圖3),測(cè)序結(jié)果表明克隆片段與預(yù)期結(jié)果完全一致。

圖3 pET28a(+)-peb1Ag重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pM D18-T-peb1Ag

2.3 重組蛋白的表達(dá)和純化

經(jīng)SDS-PAGE電泳,IPTG誘導(dǎo)的重組菌經(jīng)超聲裂解后離心的的沉淀在約29 ku處觀察到明顯的目標(biāo)蛋白條帶,上清液電泳后可見明顯的特異性蛋白表達(dá)帶,上清液重組蛋白經(jīng)His柱純化后,觀察到明顯的單一蛋白條帶(圖4),說明重組蛋白以可溶性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,用His柱純化的效果良好。

2.4 Western blot和小鼠免疫試驗(yàn)

純化的重組蛋白進(jìn)行Western blot分析,結(jié)果顯示單一的特異性條帶,大小與重組蛋白相似(圖4),說明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。純化的重組蛋白免疫小鼠獲得的血清,與重組蛋白包被的ELISA板進(jìn)行反應(yīng),第6周血清效價(jià)為1∶6 400,第7周的血清效價(jià)為1∶12 800,第8周的血清效價(jià)大于1∶12 800,說明重組蛋白具有良好的免疫原性。

圖4 重組蛋白的SDS-PAGE與Western blot分析Fig.4 Analysis of expressed recombinant protein by SDS-PAGE and Western blot

3 討論

空腸彎曲菌的抗原成分較為復(fù)雜,除鞭毛和PEB1蛋白外,還有外膜蛋白(MOMP)、趨化蛋白(CHEY)、脂多糖(LPS)、細(xì)胞致死性毒素(CDT)等[6-7],在激活機(jī)體的免疫機(jī)制的過程中也具有重要的作用。目前對(duì)于這些蛋白的作用尚不明確,通過克隆表達(dá)方式可對(duì)各個(gè)基因功能進(jìn)行充分研究,篩選出其具有免疫保護(hù)作用的表面抗原成分,并通過基因工程構(gòu)建相應(yīng)的疫苗[5,8],必將對(duì)空腸彎曲菌所致的食源性腸炎及繼發(fā)的GBS等自身免疫性疾病的防治有極重要的意義。

從細(xì)菌菌體中純化大量完整的目的蛋白十分困難,這勢(shì)必影響細(xì)菌蛋白的研究與利用。因此本研究用E.coli原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)空腸彎曲菌可能的毒力因子PEB1的基因片段進(jìn)行克隆表達(dá)。由于空腸彎曲菌peb1A基因(G+C)%含量低(31.5%),且與E.coli原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)載體密碼兼并性較差,不易于表達(dá),試驗(yàn)中曾使用過pET32a(+)、pET30、pGEX-6p-1多種載體及宿主菌直接表達(dá)空腸彎曲菌peb1A基因和flaAg基因,結(jié)果都不能表達(dá)或表達(dá)量極低(＜10%)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果利用Vector NTI軟件進(jìn)行基因組改造,合成序列peb1Ag,構(gòu)建了pET28a(+)-peb1Ag重組質(zhì)粒,用其轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后,在IPTG誘導(dǎo)下能高效表達(dá)分子質(zhì)量為29 ku的PEB1目的蛋白,蛋白表達(dá)量最大可達(dá)細(xì)菌總蛋白的70%左右,并有良好的免疫原性和反應(yīng)原性,為空腸彎曲菌表面蛋白研究以及建立相應(yīng)的檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

[1]Munroe D L,Prescott J F,Penner J L.Campylobacter jejuniandCampylobacter coliserotypes isolated from chickens,cattle,and pigs[J].Clin Microbiol,1983,18:877-881.

[2]Nachamkin I,Ung H,Patton C M.Analysis of HL and O serotypes ofCampy lobacterstrains by the flagellin gene typing system[J].J Clin Microbiol,1996,34(2):277-281.

[3]Pei Z,Burucoa C,Grignon B,et al.Mutation in the peblA locus ofCampy lobacter jejunireduces interactionswith epithelial cells and intestinal colonization of mice[J].Infect and Immun,1998,66(3):938-943.

[4]Carrillo C D,Taboada E,Nash J H,et al.Genome-wide expressionanaly ses ofCampy lobacter jejuniNCTC11168 reveals coordinate regulation of motility and virulence by flhA[J].Biol Chem,2004,279(19):20327-20338.

[5]馮永嘉,蔡方成,劉 杞,等.空腸彎曲菌粘附蛋白 PEB1的克隆表達(dá)及免疫保護(hù)性初步探索[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2003,23(8):640-641.

[6]Stucki U,Frey J,Nicolet J,etal.Identification ofCampy lobacter jejunion the basis of aspecies-specific gene that encodes a membrane protein[J].Clin Microbiol,1995,33:855-859.

[7]Taylor D E,Chang N.Immunoblot and enzyme-linked immunosorbant assays ofCampy lobactermajor outer membrane protein and application to the differentiation ofCampy lobacterspecies[J].Mol Cell Probes,1987,1:261-274.

[8]Lee LH,Edwarg B,Baqar S,et al.Elvaluation of a truncated recombinant flagellin subunit vaccine againstCampy lobacter jejuni[J].Infect and Immun,1999,67(11):5799-5805.

Cloning,Expression and Immunogenicity Analysis ofCampylobacter jejunipeb1A Gene

ZHU Chang-qing1,2,TANG Tai-shan1,2,WANG Ting3,JIANG Yuan1,YAO Huo-chun2,ZHANG Chang-yin1,XUE Feng1,LUAN Jun1

(1.J iangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing,J iangsu,210001,China;2.College of Veterinary Medicine,N anjing Agricultural University,Nanjing,Jiangsu,210095,China;3.College of Animal Science and Technology,Luoyang,Henan,471003,China)

Based on theC.jej unigenes in GenBank,the peb1A genes was amplified by PCR fromC.jejunigenomic DNA.The PCR fragments were cloned into the pMD18-T vector and sequenced.The sequences were compared with the peb1A genes of different kinds ofC.jejunistrains to analyze their homology and diversity degree.The DNA fragment of peb1Ag gene ofC.jej uniwas optimized and synthesized in accordance with theE.coli＇s codon preference,it was inserted to the expression vector pET-28a(+).The recombinant expression plasmid pET-28a(+)-peb1Ag was transformed intoE.coliBL21(DE3),and the recombinant protein PEB1 was expressed,purified,and detected by Western blot and the mouse immunologic test.The results showed the recombinant protein PEB1 possessed the good immunogenicity.

Campylobacter jej uni;peb1A gene;cloning;expression;immunogenicity

S852.613

A

1007-5038(2011)09-0001-04

2011-03-01

國家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(2008IK145)

祝長青(1973-),男,山東濰坊人,高級(jí)工程師,碩士,主要從事食品生物安全研究與檢驗(yàn)研究。