楊建泉，錢 琨，顧丙泉，王明珍，金文杰，秦愛建＊

（1.禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇揚州 225009；2.江蘇如東縣畜牧獸醫(yī)站，江蘇南通 226400；3.江蘇省南通市動植物進出境檢疫局，江蘇南通 226000）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種以妊娠母豬嚴重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高病死率為特征的傳染病。其病原PRRSV屬于套式病毒目（Nidovirales）、動脈炎病毒科（Arteriviridae）、動脈炎病毒屬（Arterivirus）成員。PRRSV的基因組為單股、不分節(jié)段的正鏈RNA，大小約15kb，包含有相互重疊的9個開放閱讀框（open reading frames，ORFs），分別為 ORF1a、ORF1b、ORF2－ORF7。其中 ORF1包括ORF1a和ORF1b，位于基因組的5′端，長約12kb，約占整個基因組的80%，編碼病毒復(fù)制所必需的非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural proteins，Nsps）。ORF2－ORF7位于病毒基因組3′端，全長約3kb，占整個病毒基因組20%，是病毒基因組的結(jié)構(gòu)基因，主要編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5以及非糖基化囊膜基質(zhì)蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）［1］。

PRRS于1987年在美國的北卡羅納、衣阿華等州首先報道，不久即傳遍到了中西部，并在全美迅速蔓延。隨后加拿大、德國、荷蘭等一些國家先后暴發(fā)了該病。自1991年，亞洲地區(qū)的日本、韓國、菲律賓、我國臺灣等都相繼報道了該?。?］。我國大陸于1996年首次報道并分離到病毒［2］。現(xiàn)在PRRS已經(jīng)成為世界性疾病，遍及世界各主要養(yǎng)豬國家與地區(qū)，并己成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的傳染病之一。2006年以來，我國暴發(fā)了一種以高熱、高發(fā)病率、高死亡率為特征的“豬高熱綜合征”。通過國內(nèi)學(xué)者的大量研究，證實高致病性PRRSV變異株是“豬高熱綜合癥”的主要病因。其病毒基因與典型PRRSV相比在多處發(fā)生了特異性的變異，因此高致病性PRRSV 有 時 也 稱 之 為 非 典 型 性 PRRSV［3－7］。PRRSV遺傳及抗原性差異很大且易發(fā)病毒間重組，導(dǎo)致病毒基因組極易發(fā)生變異，因此如何弄清當(dāng)前PRRSV流行毒株，特別是病毒ORFs的分子流行病學(xué)及變異規(guī)律，對有效診斷，并研制有針對性的疫苗，從而提高當(dāng)前PRRSV疫苗保護率有著至關(guān)重要的作用。

本研究以江蘇地區(qū)發(fā)病豬場為研究對象，發(fā)病現(xiàn)場采集病料分離病毒并鑒定，對不同分離株的分子遺傳特征進行比較、分析，研究其遺傳變異規(guī)律。研究結(jié)果對選擇具有地方代表性的疫苗毒株，采取有針對性的措施來防控和消滅類似疫病的再次暴發(fā)和流行有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料來自規(guī)模豬場患病豬的新鮮淋巴結(jié)和肺臟組織以及2007年－2010年采集的江蘇不同地區(qū)發(fā)病豬的肺、脾、腎、淋巴結(jié)等組織病料。樣品采集地均暴發(fā)“豬高熱綜合征”，以患病豬體溫升高，大批懷孕母豬流產(chǎn)，斷奶仔豬死亡為主要特征，這些豬場均未免疫過PRRS疫苗。

1.1.2 細胞與病毒 Marc－145細胞由中國農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所袁世山研究員惠贈；陽性對照JXwm06病毒液由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)楊漢春教授惠贈。

1.1.3 主要試劑 高糖型DMEM為GIBCO公司產(chǎn)品；新生牛血清（NBS）為蘭州民海生物公司產(chǎn)品；RNasin Inhibitor、dNTP 、1kb DNA Marker、Taq DNA聚合酶為Fermentas公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶（MMLV）、T4DNA Ligase、pGEM T easy為Promega產(chǎn)品；AxyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit為美國AxyGEN公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000為TaKaRa公司產(chǎn)品；抗PRRSV N蛋白特異性單克隆抗體由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)楊漢春教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 參考GenBank登陸的基因序列，在Nsp2基因缺失區(qū)的兩端保守區(qū)設(shè)計了一對引物，經(jīng)典毒株擴增片段為734bp，而高致病性PRRSV擴增片段為644bp，上游引物為Nsp2－F 5′－ATCCCAGCCGCTCTGGCCGAA－3′，下游引物為Nsp2－R 5′－GACAGGAGCTGCTTGATGACAC－3′；另外，參照PRRSV VR2332株和CH－1a株的全長基因組序列，將PRRSV的全長基因組分為13個相互重疊的基因片段，設(shè)計了13對引物（表1）用于病毒全基因組的擴增。

1.2.3 病毒Nsp2基因和全序列基因組PCR擴增按照AxyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit進行病毒RNA的提取，并用 M－MLV reverse transcriptase（Promega，USA）進行cDNA合成用于PCR擴增。

1.2.3.1 Nsp2基因擴增 取1μL cDNA為模板，依次加入10×buffer 5μL、Mg2＋4μL、dNTP（10 mmol／L）2μL、用于檢測PRRSV Nsp2基因片段的上下游引物 （25pmol／L）各1μL、Taq DNA 聚合酶（5U／μL）1μL，加超純水至總體積為50μL。反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃1min，59℃1min，72℃1min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳回收純化陽性條帶連接到T載體，經(jīng)驗證后送上海Invitrogen公司測序。

1.2.3.2 PRRSV全長基因的擴增 PCR總體積采用50μL體系，依次加入以下試劑：10×PCR buffer 5μL、Mg2＋4μL、dNTPs（10mmol／L）2 μL、P1（25pmol／μL）1μL、P2（25pmol／μL）1μL、Taq DNA polymerase（5U／μL）1μL、cDNA 1μL，最后補加滅菌超純水至50μL，輕輕混勻后，按下列反應(yīng)參數(shù)進行PCR擴增。反應(yīng)條件為95℃5min；94℃1min，根據(jù)各對引物的Tm值設(shè)置的退火溫度退火1min，72℃1.5min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收純化陽性條帶連接到T載體，經(jīng)驗證后送上海Invitrogen公司測序。

1.2.4 病毒分離培養(yǎng) 無菌采集血液與組織病料。血液在4℃條件下，8 000r／min離心10min，收集上清接種細胞；采集的組織病料，加入3倍～5倍體積的DMEM培養(yǎng)基和青鏈霉素，用勻漿器研磨后，將組織勻漿凍融3次，然后于8 000r／min離心10 min，收集上清接種細胞。

表1 Nsp2部分基因及RD2007株病毒全基因組擴增引物Table1 Primers used to amplify the whole genome of RD2007and partial Nsp2gene

Marc－145細胞長成單層后，棄上清，用超純水配制的PBS洗滌細胞表面，棄PBS洗液，接種1mL待檢樣品，37℃吸附2h，棄去樣品，添加含10 mL／L小牛血清的DMEM維持液，置于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中。連續(xù)培養(yǎng)6d～7d，每天觀察細胞病變情況。

1.2.5 間接免疫熒光鑒定 接種待檢病料的細胞孔待出現(xiàn)明顯細胞病變時，棄去培養(yǎng)液，每孔加入200μL預(yù)冷的固定液（丙酮∶乙醇＝3∶2）固定5 min。棄去固定液，用PBS洗滌、置超凈臺吹干，4℃過夜，加入適當(dāng)稀釋的抗PRRSV N蛋白單抗，200 μL／孔，37℃溫育45min，PBS洗滌，加入200μL的1∶100稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG（SIGMA），37℃溫育45min，用PBS洗滌3次，每次5min，熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。

1.2.6 基因序列比對與分析 應(yīng)用DNA Star和MEGA 4軟件對測序序列連同已發(fā)表的PRRSV核苷酸序列進行遺傳變異分析，確定PRRSV江蘇分離株與已發(fā)表的PRRSV核苷酸和氨基酸序列的同源性，同時繪制系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 江蘇地區(qū)的PRRSV的PCR結(jié)果

利用材料方法中的Nsp2基因引物對臨床送檢病料進行RT－PCR擴增，Nsp2－F和 Nsp2－R引物能夠從病料中特異性的擴增出644bp大小的條帶，證實江蘇地區(qū)近年來仍然有高致病性PRRSV存在（圖1）。

2.2 臨床PRRSV分離與鑒定

將處理后的病料接種于Marc－145細胞分離病毒，觀察細胞病變并利用間接免疫熒光試驗（IFA）和RT－PCR試驗對分離病毒進行鑒定，結(jié)果證實從臨床病料中分離得到了PRRSV，并命名為PRRSV RD2007株（圖2）。

2.3 PRRSV RD2007株基因組全序列測定及序列分析

經(jīng)PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化獲得全基因的13個片段（圖3），克隆測序，將獲得的序列信息拼接后，獲得PRRSV RD2007株的全基因組序列。PRRSV RD2007株基因組全長15 319bp，包含9個開放閱讀框，與美洲型分離株各個基因區(qū)段的長度相近，在Nsp2基因中有不連續(xù)的30個氨基酸的缺失。

圖1 部分臨床樣品的RT－PCR擴增結(jié)果Fig.1 RT－PCR results of partial clinical samples

圖2 RD2007株病毒分離鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of PRRSV RD2007strain

圖3 PRRSV－RD－2007株各基因的分段擴增結(jié)果Fig.3 Divided fragments of RD2007 genome for amplification

應(yīng)用DNA Star軟件對不同PRRSV分離株的各個開放閱讀框進行序列同源性的分析。結(jié)果顯示，RD2007株與國內(nèi)外各美洲型分離株的全基因序列核苷酸同源性在88.8%～99.3%之間，而與歐洲型代表毒株LV的全基因序列核苷酸同源性只有60.7%比較結(jié)果。各個基因片段同源性分析顯示，PRRSV RD2007株的ORF1a同其他分離株相應(yīng)片段差異明顯，主要是因為Nsp2存在缺失引起的。與22個美洲型PRRSV代表毒株的ORF1a的核苷酸同源性在87.1%～99.1%。變異較大的蛋白還包括GP3和GP5，與22個美洲型PRRSV代表毒株的GP3和GP5的同源性分別在88.6%～100%和88.7%～99.5%之間。

將PRRSV RD2007株與其余34株P(guān)RRSV全長基因組序列進行多重序列比對，運用DNA Star繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RD2007株與美洲型代表毒株VR－2332處于同一分支，與歐洲型代表毒株LV的遺傳距離較遠，屬于美洲型毒株。同時與其他10株高致病性PRRSV（JXA1、HUN4、YN2008、Henan－1、HUB1、SY0608、LN、SHH、GDSD1、HEB1）的親緣關(guān)系最近（圖4）。

2.4 PRRSV RD2007株ORF5基因遺傳變異分析

PRRSV RD2007株ORF5基因由603bp組成，編碼201個氨基酸。氨基酸同源性序列比較分析表明，RD2007株與美洲型代表毒株VR－2332的氨基酸同源性是89.4%，與國內(nèi)最早分離到的PRRSV CH1a株和BJ－4株的氨基酸同源性分別為90.5%和86%。與高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1和HUN4的同源性分別是99.0%、99.5%和99.5%。然而與歐洲型PRRSV代表毒株LV株的氨基酸同源性只有59.2%。氨基酸序列分子遺傳比較分析，發(fā)現(xiàn)在GP5序列中存在兩個高變區(qū)，分別位于N端信號肽和抗原表位處。同時分離株的ORF5基因還存在較高的氨基酸點突變，突變位置主要集中于3位～39位N端信號肽區(qū)域附近。其中，13位與151位氨基酸均為R，具有強毒株的特征；分離株的L39突變?yōu)镮39，而位于中和表位之前一位非中和表位A29突變?yōu)閂29。

圖4 PRRSV分離株全長基因組序列的進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis based on full－length PRRSV RD2007sequence

3 討論

RT－PCR檢測結(jié)果顯示臨床病料中的病毒都為高致病性的PRRSV，包括分離株P(guān)RRSV RD2007株在內(nèi)，第481位氨基酸和533位～561位氨基酸都存在不連續(xù)的30個氨基酸缺失，Nsp2基因的這一特征與已報道的2006年以來在我國流行的高致病性PRRSV缺失部位完全一致，從而再一次證實PRRSV為“豬高熱綜合征”的主要病原［8－11］。試驗結(jié)果還表明高致病性PRRSV仍然在江蘇部分地區(qū)存在，雖然大部分養(yǎng)殖場都已經(jīng)進行了疫苗免疫，這可能與PRRSV各分離株之間存在著廣泛的抗原多樣性有關(guān)。

PRRSV各型不同毒株之間的變異率可以高達10%，而在PRRSV眾多編碼的蛋白中GP5是最容易發(fā)生變異的基因之一，GP5的變異主要集中在一級序列的變化，糖基化位點的缺失或修飾等方面［1］。本研究中江蘇地區(qū)分離株P(guān)RRSV RD2007ORF5編碼的氨基酸序列與其他23個國內(nèi)外毒株的ORF5的氨基酸序列進行遺傳變異比較分析發(fā)現(xiàn)，與美洲型代表毒株VR－2332的氨基酸同源性是89.4%，與國內(nèi)最早分離到的PRRSV CH1a株和BJ－4株的氨基酸同源性分別為90.5%和86%。與高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1和HUN4的同源性分別是99.0%、99.5%和99.5%，然而與歐洲型PRRSV代表毒株LV株的氨基酸同源性只有59.2%，說明隨著時間的推移，PRRSV RD2007株病毒發(fā)生了變異。根據(jù)ORF5氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)分離到的PRRSV全基因組中ORF5基因存在較高的氨基酸點突變，突變位置主要集中于3～39位N端信號肽區(qū)域附近，與以往的報道一致［1，12］。其中，13位與151位氨基酸均為R，具有強毒株的特征；分離株的L39突變?yōu)镮39，而位于中和表位之前一位非中和表位A29突變?yōu)閂29，該非中和表位能夠延緩機體產(chǎn)生中和抗體，從而可能促進病毒逃避機體的體液免疫。造成這些突變的主要原因可能是在生存選擇的壓力下，病毒總是朝著有利于在宿主間傳播和在宿主體內(nèi)持續(xù)存在的方向變異。這些氨基酸的變異對GP5蛋白親水性、疏水性和抗原性等特性有何影響，是否會導(dǎo)致病毒毒力的變化還有待進一步的研究與分析。通過對分離株RD2007的分子遺傳變異分析表明，其全長基因組序列與美洲型代表毒株VR－2332的同源性為89.2%，與歐洲型代表毒株LV的同源性為60.7%，而與高致病性PRRSV的同源性在98.5%～99.3%。從全基因組進化樹分析發(fā)現(xiàn)，美洲型毒株與歐洲型毒株分別處在兩個不同的分支。RD2007株與美洲型代表毒株VR－2332處于同一分支，與歐洲型代表毒株LV的遺傳距離較遠，屬于美洲型毒株。在美洲型PRRSV分支中，2006年以來分離鑒定的高致病性PRRSV又處于同一個分支，顯示了較高的親緣關(guān)系，據(jù)此推測此分離毒株與高致病性PRRSV代表株可能有著共同的起源。

本研究利用RT－PCR方法檢測了2007年－2010年間江蘇省PRRSV流行情況，并分離了PRRSV RD2007毒株，進行了全基因組分子遺傳變異的分析，為PRRSV的快速診斷和鑒定流行PRRSV的基因型奠定了基礎(chǔ)，同時為江蘇省PRRSV疫苗毒的選擇提供了依據(jù)。

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