王貴華，陳義鋒，劉明明，陳翠云，趙亞榮

（北京大北農(nóng)動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100097）

由豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV－2）引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）自20世紀(jì)90年代初被鑒定以來，該病已給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重危害。研究表明，PCV－2感染除了造成PMWS，同時(shí)還與豬呼吸道綜合癥（Porcine respiratory disease complex，PRDC）、豬皮炎和腎病綜合 征 （porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PNDS）、先天性震顫、繁殖障礙、胎兒心肌炎和擴(kuò)張性壞死性肺炎等豬圓環(huán)病毒?。≒orcine circovirus associated－disease，PCVAD）密切相關(guān)［1］，已成為影響世界養(yǎng)豬業(yè)的最重要的病毒性傳染病。

流行病學(xué)調(diào)查［2－3］表明，當(dāng)前我國豬場(chǎng)的 PCV－2感染已相當(dāng)普遍，由PCV－2感染引起的PCVAD已經(jīng)給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且PCV－2基因組在不斷地發(fā)生變異，PCV－2b基因型已取代PCV－2a成為當(dāng)前的優(yōu)墊基因型毒株［4］，新毒株或新基因型仍在不斷出現(xiàn)［5］。為了解當(dāng)前國內(nèi)感染豬群中PCV－2的基因變異情況，并為PCV－2的分子流行病學(xué)、感染及預(yù)防控制提供參考，本研究對(duì)來自山東、山西、北京和河北的PCV－2PCR檢測(cè)核酸陽性的病料進(jìn)行PCV－2分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織病料 采自山東、山西、北京和河北的具有PMWS癥狀和剖檢病變的自然病例的淋巴結(jié)（氣管支氣管淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)）、肺臟、脾臟和扁桃體等組織，置于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 細(xì)胞和血清 PK－15A細(xì)胞由北京大北農(nóng)動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究中心實(shí)驗(yàn)室保存；感受態(tài)JM109細(xì)胞為北京索來寶公司產(chǎn)品；胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；PCV－2陽性血清由周繼勇教授惠贈(zèng)。

1.1.3 試劑 EX－Taq DNA聚合酶（含10×buffer，dNTPs）為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000為北京博邁德公司產(chǎn)品；PCV－1和PCV－2PCR檢測(cè)試劑盒為中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心產(chǎn)品；FITC標(biāo)記羊抗豬IgG為Lifeholder公司產(chǎn)品；MEM、EDTA、胰酶（1／250）為Gibco公司產(chǎn)品；D－Glucosmine－HCl，為Sigma公司產(chǎn)品，pMD－18TSimple載體和DNA Ligase為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和血液、組織細(xì)胞DNA抽提試劑盒均為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PCR檢測(cè) 按照豬圓環(huán)病毒聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，即同時(shí)用三條引物P1（5′－CCGCGGGCTGGCTGAACTT－3′）、P2（5′－CTCGGCTATGCGCTCCAAAATG－3′）和 P3 （5′－ACCCCCGCCACCGCTACC－3′）分別對(duì)病料中 PCV－1（P1和P2擴(kuò)增產(chǎn)物為652bp）和PCV－2（P1和P3擴(kuò)增產(chǎn)物為1 154bp）進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，62℃45s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

1.2.2 病毒分離 取PCR檢測(cè)PCV－2陽性的病料，經(jīng)處理后按50mL／L的比例接種60%～70%融合的PCV陰性的PK－15A細(xì)胞，置37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中吸附30min，加入含20 mL／L新生牛血清和3mmol／L的D－氨基葡萄糖鹽酸的MEM細(xì)胞維持液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48h，連續(xù)盲傳3代。觀察是否有病變產(chǎn)生，并將第3代細(xì)胞置－15℃／室溫反復(fù)凍融3次，3 000r／min離心20 min，取上清進(jìn)行PCR（同1.2.1法）和IFA鑒定。

1.2.3 特異性鑒定（用IFA法） 將已長成單層的PK－15A細(xì)胞（24孔板）倒去生長液，以50mL／L的比例接入各分離株的盲傳細(xì)胞培養(yǎng)物并設(shè)重復(fù)孔4孔，同時(shí)設(shè)陰陽性對(duì)照。置37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，換含3mmol／L的D－氨基葡萄糖鹽酸的MEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。棄去維持液，用0.01mol／L pH 7.4PBS洗滌3次，冷丙酮固定細(xì)胞，50μL／孔，4℃30min，棄丙酮，室溫下干燥，用0.01mol／L pH7.4PBS洗滌1次，加入1∶100稀釋的PCV－2抗體，50μL／孔，37℃1h；移去孔內(nèi)液體，用0.01mol／L pH7.4PBS洗滌5次，每次3min；加入1：20稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗豬二抗，50μL／孔，37℃1h；移去孔內(nèi)液體，用0.01 mol／L pH7.4PBS洗滌5次，每次3min，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4 全基因組克隆和測(cè)序 參考文獻(xiàn)［6］合成了兩 對(duì) 引 物 P1：5′－CGAATTCAACCTTA ACCTTTCTTATTC －3 和 P2：5′－ATGAATTCTGGCCCTGCTCCC－3′，擴(kuò)增條件為：95℃變性5min；94℃45s，54℃45s，72℃1min；共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物凝膠回收，連接至pMD－18TSimple載體，轉(zhuǎn)化至JM109細(xì)胞，搖菌擴(kuò)增，并將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送檢測(cè)序。并用MEGA5的Neighbor－Joining法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。PCR檢測(cè)結(jié)果表明，5個(gè)分離株均可擴(kuò)增出1 154bp片段，與PCV－2陽性對(duì)照一致，均未檢測(cè)到與PCV－1陽性對(duì)照一致大?。?52bp）的特異性片段。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

PCV－2各 分 離 株 DBN－SD02、DBN－SX07、DBNBJ08、DBN－HB12和DBN－HB13PCR檢驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 病料中PCV－2的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR detection result of PCV－2in samples

2.2 特異性鑒定結(jié)果

PCV－2各分離株DBN－SD02、DBN－SX07、DBNBJ08、DBN－HB12和 DBN－HB13株感染PK15A 細(xì)胞后，感染細(xì)胞均可與PCV－2陽性血清特異性結(jié)合，并被FITC標(biāo)記的羊抗豬二抗結(jié)合，熒光顯微鏡下見到感染細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)和胞核內(nèi)均有大量綠色熒光物質(zhì)著染，而健康細(xì)胞對(duì)照孔則未見到特異性熒光（圖2）。表明PCV－2各分離株均可被PCV－2陽性血清特異性識(shí)別。

圖2 PCV－2各分離株特異性鑒定結(jié)果（200×）Fig.2 Specificity identification of PCV－2isolates by IFA （200×）

2.3基因組克隆及測(cè)序

用全基因組序列擴(kuò)增引物分別對(duì)PCV－2DBNSD02、DBN－SX07、DBN－BJ08、DBN－HB12和 DBNHB13株的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖3）。

全基因組PCR產(chǎn)物分別經(jīng)切膠回收，連接至T載體，送博邁德測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交GenBank，登錄號(hào)分別為FJ660967、FJ660968、FJ660969、FJ660970和FJ660971。

2.4 同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA5的Neighbor－Joining法將所分離5株P(guān)CV－2（帶下劃線）的ORF2和全基因組序列分別與PCV－2aPCV－2bPCV－2c基因型參考毒株進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，大于50% 的Bootstrap Test（1 000replicates）的Bootstrap值顯示在鄰支之間，結(jié)果見圖4。

圖4上為依據(jù)ORF2推導(dǎo)氨基酸序列比對(duì)結(jié)果繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹；圖4下為依據(jù)全基因組核苷酸序列比對(duì)結(jié)果繪制的系統(tǒng)根據(jù)進(jìn)化樹。由圖可知，兩種方法所繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹均表明所分離的5株P(guān)CV－2（下劃線）中有4株（DBN－HB12、DBN－SD02、DBN－SX07和DBN－HB13）屬于PCV－2b基因型，僅DBN－BJ 08株為PCV－2a基因型。

圖3 PCV－2各分離毒株全基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The genome amplification results of PCV－2isolates

圖4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis

3 討論

關(guān)于PCV－2兩種基因型的命名，不同的研究組織常使用不同的命名，如“A”和“B”、“SG1”和“SG2”、“1”和“2”、“b”和“a”，以及根據(jù)限制性多態(tài)性片段（RFLP）模式分成的“321”和“422”等，面對(duì)這種局面，Grau－Roma L等［8］提出了一種客觀精確命名PCV－2基因型的方法，該方法根據(jù)序列間遺傳距離（p－distance）不同進(jìn)行分類，遺傳距離的計(jì)算方法是用差異的核苷酸位點(diǎn)數(shù)除以總位點(diǎn)數(shù)［9］，通過構(gòu)建遺傳距離直方圖，確定不同基因型間的最低檢測(cè)值。通過這項(xiàng)技術(shù)，已經(jīng)有3種基因型的PCV－2病毒被鑒定出來，分別為 PCV－2a、PCV－2b、PCV－2c。并且分別將GenBank中最早的報(bào)道的原型毒株AF055392和 AF055394分別作為PCV－2a和PCV－2b參考株，將20世紀(jì)80年代只有在丹麥發(fā)現(xiàn)的PCV－2EU148503作為PCV－2c的參考株。有證據(jù)顯示，在1997年－2003年之間，不論是否存在PMWS疾病，豬場(chǎng)當(dāng)中都是PCV－2a基因型病毒占主導(dǎo)地位，而從2004年P(guān)MWS暴發(fā)之后，PCV－2b毒株則變得越來越普遍。PCV－2c型病毒只有20世紀(jì)80年代在丹麥發(fā)現(xiàn)過，那時(shí)PMWS尚未出現(xiàn)，或者至少尚未被發(fā)現(xiàn)［10］。

本研究從疑似PMWS病例中分離鑒定了5個(gè)PCV－2毒株，并且對(duì)其全基因組進(jìn)行了克隆和測(cè)序，分別以推導(dǎo)ORF2氨基酸序列和全基因組核苷酸序列與參考株進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果均顯示有4株為PCV－2b亞型，1株為PCV－2a亞型，表明基于PCV－2全基因組序列或ORF2序列對(duì)其基因型進(jìn)行鑒定所獲得的結(jié)果是一致的，這與Olvera A等［11］的研究結(jié)果一致，同時(shí)也表明PCV－2b基因型是我國當(dāng)前PCV－2的主要流行血清型。

［1］Chae C.A review of porcine circovirus 2－associated syndromes and diseases［J］.Vet J，2005，169（3）：326－336.

［2］周繼勇，陳慶新，葉菊秀，等.豬圓環(huán)病毒2型感染的血清學(xué)分析［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，24（1）：1－3.

［3］王忠田，楊漢春，郭 鑫.規(guī)模化豬場(chǎng)豬圓環(huán)病毒2型感染的流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國獸醫(yī)雜志，2002，38（10）：3－6.

［4］Guo LJ，Lu YH，Wei YW，et al.Porcine circovirus type 2（PCV－2）：genetic variation and newly emerging genotypes in China［J］.Virol J，2010，7：273.

［5］郭抗抗，張彥明，張 紅，等.豬圓環(huán)病毒2型分離株優(yōu)勢(shì)基因型分析與檢測(cè)［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，32（10）：808－811.

［6］馮志新，范偉興，李曉成，等.PMWS病豬豬圓環(huán)病毒2型全基因組序列分析［J］.中國病毒學(xué)，2004，19（5）：454－457.

［7］李文潔，李文濤，嚴(yán)偉東，等.中國部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的基因型分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，40（9）：1358－1362.

［8］Grau－RomalL，Criscie E，SibIla M，et al.A proposal on porcine circovirus type 2 （PCV－2）genotype definition and their relation with postweaning multisystemic wasting syndrome（PMWS）occurrence［J］.Vet Microbiol，2008，128：23－35.

［9］Kumar S，Tamura K，Jakobseni B，et al.MEGA2：molecular evolutionary genetics analysis software［J］.Bioinformatics，2001，17：1244－1245.

［10］Segalés J，Olvera A，Grau－Roma L，et al.PCV－2genotype definition and nomenclature［J］.Vet Rec，2008，162：867－868.

［11］Olvera A，Cortey M，Segalés J.Molecular evolution of porcine circovirus type 2genomes：phylogeny and clonality［J］.Virology，2007，357：175－185.