李雯雯，李 健，李樹(shù)清，張鴻滿(mǎn)，黃維義

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海200135；3.廣西疾病預(yù)防控制中心，廣西南寧530021）

桂林蛇源裂頭蚴分離株的分子鑒定及種系發(fā)育關(guān)系分析

李雯雯1，李 健1，李樹(shù)清2＊，張鴻滿(mǎn)3，黃維義1

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海200135；3.廣西疾病預(yù)防控制中心，廣西南寧530021）

為研究從桂林草花蛇中分離到的裂頭蚴的分子分類(lèi)地位，對(duì)其核糖體18SrDNA、28SrDNA、ITS全基因及線(xiàn)粒體cox1部分基因進(jìn)行了克隆和序列分析。從GenBank獲取相應(yīng)基因序列，應(yīng)用CLUSTAL W2軟件進(jìn)行多重比對(duì)分析序列差異，應(yīng)用MEGA 4.0軟件構(gòu)建種系發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，在基于18S、28S基因序列構(gòu)建的種系發(fā)育樹(shù)中，本株裂頭蚴分別與歐猥迭宮絳蟲(chóng)（D64072）18S構(gòu)成一個(gè)單獨(dú)分支，自展值為100%；與擬曼迭宮絳蟲(chóng)（AF004718）、歐猥迭宮絳蟲(chóng)（AF004717）、無(wú)頭蚴絳蟲(chóng) （AF096223）28S同屬一個(gè)分支，自展值61%?；贗TS1、ITS2和cox1部分基因序列構(gòu)建的種系發(fā)育樹(shù)與所有歐猥迭宮絳蟲(chóng)均構(gòu)成同一亞群，總分支自展值分別為100%、99%、64%，三者在不同的分離株之間呈現(xiàn)基因多態(tài)性，從總分支自展值來(lái)看cox1比ITS更適合用于種內(nèi)遺傳多態(tài)性研究，ITS適合做定種的分子標(biāo)記。

裂頭蚴 ；小亞基；大亞基；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)；細(xì)胞色素c氧化酶第I亞基

＊通訊作者

裂頭蚴（Plerocercoid）是假葉目（Pseudophyllidea）裂頭科（Diphyllobothriidea）絳蟲(chóng)蚴的總稱(chēng)。人類(lèi)因食入含有活裂頭蚴的魚(yú)類(lèi)或兩棲類(lèi)動(dòng)物而引起的感染性疾病稱(chēng)為人裂頭蚴?。℉uman plerocercoidosis）。其中，裂頭科絳蟲(chóng)中以裂頭屬（Diphyllobothrium）及迭宮屬（Spirometra）兩類(lèi)絳蟲(chóng)為主要的致病種。迭宮絳蟲(chóng)屬至今共記載了超過(guò)10個(gè)種［1］，被公認(rèn)為有效種的有歐猬迭宮絳蟲(chóng) （S.erinaceieuropaei或S.erinacei）以及擬曼迭宮絳蟲(chóng)（S.mansonoides）［2］，前者呈世界性分布，后者主要分布于美國(guó)［3］。迭宮屬裂頭蚴寄生的宿主有蛇、蛙，成蟲(chóng)寄生于貓、狗等哺乳動(dòng)物，人類(lèi)也有感染迭宮絳蟲(chóng)成蟲(chóng)的病例報(bào)道。由迭宮屬裂頭蚴感染導(dǎo)致人裂頭蚴病的病例，全球已報(bào)道有1 400例，其中以我國(guó)為最多［3］。由于南方飲食習(xí)慣中較為普遍的食用蛇、蛙等動(dòng)物，這是人感染該病原的主要途徑。鑒于人迭宮屬裂頭蚴病已成為重要的食源性寄生蟲(chóng)病，了解及掌握裂頭蚴的種類(lèi)與分布情況，對(duì)該病的有效控制和預(yù)防有著重要的公共衛(wèi)生意義。

以從廣西桂林市售草花蛇（Amphiesmastolatum）分離到的一株裂頭蚴做為研究對(duì)象。經(jīng)形態(tài)初步鑒定其應(yīng)隸屬于迭宮屬絳蟲(chóng)后，通過(guò)對(duì)該株裂頭蚴的核糖體小亞基（18SrDNA）、大亞基（28SrDNA）、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）全基因及線(xiàn)粒體細(xì)胞色素c氧化酶第1亞基部分基因（pcox 1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，進(jìn)行分子種系發(fā)育分析，旨在闡明這株裂頭蚴的分子分類(lèi)學(xué)地位，并為將來(lái)的分子診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲(chóng)體樣品 2010年4月由廣西疾病預(yù)防控制中心從桂林購(gòu)買(mǎi)的草花蛇中分離收集，4℃保存于700mL/L乙醇。

1.1.2 主要試劑 rTaq酶、PCR 試劑、PMD18－T載體和DNA Marker DL 2 000均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒（DNeasy Blood＆Tissue kit）為QIAGEN公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒為天根生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 酒精固定的蟲(chóng)體樣本用去離子水反復(fù)清洗12h～24h，每隔2h換水1次。按照DNA提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取裂頭蚴蟲(chóng)體基因組DNA，將提取的基因組DNA置于－20℃保存?zhèn)溆谩?.2.2 PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序 18SrDNA基因擴(kuò)增引物 根 據(jù) 文 獻(xiàn) ［4］設(shè) 計(jì) ，PL2F：5′－ACCTGGTTGATCCTGCCAG－3′；PL2R：5′－CTTCCGCTGGTTCACCTACGG－3′。28SrDNA D1－D3基因擴(kuò)增引物 根 據(jù) 文 獻(xiàn) ［5］設(shè) 計(jì)，PL3F：5′－TAGGTCGACCCGCTGAAYTTAAGCA－3′；PL3R：5′－GGAACCCTTCTCCACTTCAGTC－3′。ITS基因序列擴(kuò)增引 物 自 行 設(shè) 計(jì)，18S－DF1：5′－ACTTGATCATTTAGAGGAAGT－3′； 28S－DR4： 5′－CTCCGCTTAGTGATATGCT－3′。pcox1基因引物根據(jù)文獻(xiàn)［6］設(shè) 計(jì) ，PL－cox1F：5′－TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT－3′； PL－cox1R： 5′－TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG－3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

反應(yīng)體系25μL：2.5μL 10×buffer，2.5μL 25 mmol/L MgCl2，2.5μL 2.5mmol/L dNTP Mixtrue，10μmol/L引物各0.5μL，0.2μL 5U/μLTaqDNA聚合酶，2.5μL DNA模板，加無(wú)菌雙蒸水至25 μL。18S與28S擴(kuò)增程序：96℃預(yù)變性5min；96℃1min，44℃1min，72℃2min，5個(gè)循環(huán)；然后將退火溫度升至48℃擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。ITS與pcox1擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后電泳切膠回收，PCR膠回收產(chǎn)物與pMD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，增菌后送Invitrogen生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 DNA序列數(shù)據(jù)的處理及分子系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建

從GenBank獲取已登錄的所有裂頭科絳蟲(chóng)的18 S及28S基因序列，迭宮屬絳蟲(chóng)ITS基因序列、pcox1基因序列進(jìn)行種間和種內(nèi)對(duì)比。ITS序列信息如 下：S.erinacei（FJ886746－FJ886755）。pcox1序 列 信 息：S.erinacei（GQ999949－GQ999957，F(xiàn)J886765－FJ886773， AB278573 － AB278575，AB369249 －AB369251， AB480297， AJ308259－AJ308265），Sparganumproliferum（AB015753）。應(yīng)用Lasergene 6（SeqMan）對(duì)以上序列以及此次測(cè)序結(jié)果進(jìn)行人工校對(duì)。18S及28S基因序列分別以圓葉目的擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(chóng)（Monieziaexpansa）（GU817405）和葉狀裸頭絳 蟲(chóng) （Anoplocephala perfoliata）（AY569769）為外類(lèi)群；ITS1、ITS2 及pcox1分別以裂頭屬絳蟲(chóng)（Diphyllobothrium）相應(yīng)序列為外類(lèi)群。應(yīng)用Clustal W2在線(xiàn)軟件（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）進(jìn)行多重序列比對(duì)后，利用 MEGA 4.0［7］用最大簡(jiǎn)約法（maximum parsimony，MP）與鄰位相連法（neighbor－joining，NJ）分別構(gòu)建50%多數(shù)一致樹(shù)，自展值（Bootstrap values）重復(fù)1 000次。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

18S、28S基因PCR均擴(kuò)增出了約2 000bp的片段，ITS大小約為1 300bp，pcox1約為450bp，均與預(yù)期的片段長(zhǎng)度相符（圖1）。

2.2 測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析結(jié)果

本株裂頭蚴18S、28S、ITS、pcox1基因測(cè)序長(zhǎng)度分別為2 172、2 242 、1 409、444bp。序列上傳至NCBI獲得登錄號(hào)分別為 HQ228991，HQ228992，HQ228993和HQ699076。應(yīng)用MP法與NJ法構(gòu)建的50%種系發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，僅在自展值有所差異，本文以NJ法為主進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

基于18S構(gòu)建的50%種系發(fā)育樹(shù)（圖2）中，裂頭科中各個(gè)屬基本各自構(gòu)成一個(gè)群。本株裂頭蚴（Spirometrasp.GL）與歐猥迭宮絳蟲(chóng)（D64072）構(gòu)成一個(gè)單獨(dú)分支，自展值為100%。基于28S基因序列構(gòu)建的50%種系發(fā)育樹(shù)中，由迭宮屬、無(wú)頭蚴屬構(gòu)成同一個(gè)大亞群，其中本株裂頭蚴與擬曼氏迭宮絳蟲(chóng)（AF004718）28S、歐猥迭宮絳蟲(chóng)（AF004717）、無(wú)頭蚴絳蟲(chóng) （AF096223）同屬一個(gè)分支，自展值61%。

基于ITS1與ITS2基因序列分別構(gòu)建的50%種系發(fā)育樹(shù)（圖3）顯示本株裂頭蚴與所有的歐猥迭宮絳蟲(chóng)均處于同一個(gè)亞群內(nèi)，自展值分別為100%和99%。兩個(gè)亞群內(nèi)均呈現(xiàn)多個(gè)分支。

基于pcox1基因構(gòu)建的50%種系發(fā)育樹(shù)（圖4）中所有歐猬迭宮絳蟲(chóng)形成同一個(gè)亞群，自展值為64%。亞群內(nèi)呈現(xiàn)兩個(gè)主要的拓?fù)浞种?，自展值分別為53%與76%，其中本株裂頭蚴與中國(guó)湖南黑斑蛙的裂頭蚴分離株 （GQ999957、GQ999949、GQ999950），日本人源成蟲(chóng)分離株（AB480297、AB369250、AB369251），印 度 狗 源 成 蟲(chóng) 分 離 株（AB278574、AB278575），澳大利亞狐貍源成蟲(chóng)分離株（AJ308259），以及中國(guó)狗源成蟲(chóng)分離株（FJ886765、FJ886773）處于同一分支。

圖1 Spirometrasp.桂林株18S、28S、ITS及pcox1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Analysis of PCR amplified 18S，28S，ITS and pcox1genes fromSpirometrasp.GL by agarosegel electrophoresis

圖2 基于18S（A）和28S（B）基因序列以鄰位連接法所構(gòu)建的50%多數(shù)一致樹(shù)Fig.2 A bootstrap 50%cut－off consensus tree inferred form 18Sand 28Sgene given in text using the Neighbor－Joining method

圖3 基于ITS1（A）和ITS2（B）基因序列以鄰位連接法所構(gòu)建的50%多數(shù)一致樹(shù)Fig.3 A bootstrap 50%cut－off consensus tree inferred form ITS1（A）and ITS2（B）gene given in text using the Neighbor－Joining method

圖4 基于pcox1基因序列以鄰位連接法所構(gòu)建的50%多數(shù)一致樹(shù)Fig.4 A bootstrap 50%cut－off consensus tree inferred form pcox1 gene given in text using the Neighbor－Joining method

3 討論

由于裂頭蚴的鏈體和生殖器官均未得到充分發(fā)育，無(wú)法運(yùn)用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法進(jìn)行有效的研究。通過(guò)感染終末宿主（犬、貓）將其培養(yǎng)至成蟲(chóng)，將耗費(fèi)大量的時(shí)間，而且迭宮屬絳蟲(chóng)成蟲(chóng)僅能依靠成熟孕節(jié)的子宮形狀來(lái)區(qū)分S.mansonoides和S.erinaceieuropaei兩個(gè)種［8－9］。分子生物學(xué)工具介入后，Lee S U等［10］比較觀(guān)察了S.erinaceieuropaei與S.mansonoides的遺傳距離，結(jié)果表明兩者的種系發(fā)生具有相近的共同祖先和密切的演化關(guān)系。本文首先通過(guò)裂頭科18S及28S兩個(gè)基因的系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定出本株裂頭蚴隸屬于裂頭科迭宮絳蟲(chóng)屬。

cox1基因序列與ITS基因序列常被運(yùn)用于分子發(fā)育種間及種內(nèi)研究。Zhu X Q等［11］基于pcox1基因進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)在澳大利亞不同宿主分離的S.erinaceieuropaei至少存在2種基因型。Okamoto M等［12］的研究也發(fā)現(xiàn)了不同國(guó)家分離到的S.erinaceieuropaei種內(nèi)存在不同基因型。本文所涉及的裂頭蚴株在基于pcox1基因序列構(gòu)建的種系發(fā)育樹(shù)中，與Zhu X Q研究發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)基因型處于同一分支，但相對(duì)于外類(lèi)群，總分支的自展值僅有70%。在基于ITS1與ITS2分別構(gòu)建的種系發(fā)育樹(shù)中，呈現(xiàn)幾個(gè)拓?fù)浞种У默F(xiàn)象，各分支的自展值較低，但仍可認(rèn)為ITS基因同樣在不同的分離株之間呈現(xiàn)基因的多態(tài)性，值得一提的是相對(duì)于外類(lèi)群，總分支的自展值非常高，分別為100%和99%。由此我們可推斷，在歐猥迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴分子種系發(fā)育關(guān)系研究中，運(yùn)用ITS基因序列有可能更適合于做定種的分子標(biāo)記，而cox1更適合于做種內(nèi)遺傳多態(tài)性研究。

除了ITS與cox1基因序列是歐猬迭宮絳蟲(chóng)很好的分類(lèi)鑒定的分子標(biāo)記外，線(xiàn)粒體nad基因也是該種絳蟲(chóng)理想的遺傳標(biāo)記之一。劉自逵等［13］的研究表明，猬迭宮絳蟲(chóng)nad1比cox1基因序列的種間與種內(nèi)差異要大一些，伍慧蘭［14］在對(duì)猬裂頭蚴nad 4基因的分析中也發(fā)現(xiàn)日本株和湖南株的pnad4的序列存在一定的差異。今后在裂頭蚴種群關(guān)系的研究中，可以結(jié)合這幾種基因，為蟲(chóng)株作精確的鑒定和分類(lèi)，從而有效診斷和控制裂頭蚴病的發(fā)生。

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Molecular Identification and Phylogenetic Analysis of Plerocercoid in Snakes from Guilin City

LI Wen－wen1，LI Jian1，LI Shu－qing2，ZHANG Hong－man3，HUANG Wei－yi1

（1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning，Guangxi，530005，China；2.ShanghaiEntry－exitInspectionand QuarantineBureau，Shanghai，200135，China；3.GuangxiCenterforDiseaseControlandPrevention，Nanning，Guangxi，530021，China）

To study the taxonomy position of plerocercoid from flower－waved snake in Guilin city，the nuclear 18SrDNA，28SrDNA，internal transcribed spacers（ITS）genes and the partial mitochondrial cyclooxygenase 1（cox1）gene of the plerocercoid were cloned，and the sequences analyzed.The corresponding sequences were downloaded from GenBank，and were aligned by the Clustal W2，and the phylogenetic trees were constructed by MEGA 4.0.The result showed that Guilin isolates and theS.erinaceieuropaei（D64072）18Swere clustered in the same clade based on the 18Sphylogenetic tree，bootstrap 100%.Guilin isolates were also in the same clade withS.mansonoides（AF004718）、S.erinaceieuropaei（AF004717），Sparganumsp.（AF096223）in 28S，bootstrap 61%，and in the same group with all ofS.erinaceieuropaeiITS1，ITS2and partial mitochondrial cox1gene sequences，the total branch bootstrap values were 100%，99%，64%.It showed gene polymorphism between different isolates in ITS and cox1，cox1is more suitable than ITS in studying intra－specific genetic polymorphism which considered from the bootstrap values，and ITS could be used as genetic marker for the species identification.

Plerocercoid；small subunit（18S）；large subunit（28S）；internal transcribed spacers；cyclooxygenase 1

S852.71

A

1007－5038（2011）10－0028－05

2011－04－01

國(guó)家質(zhì)檢總局科技專(zhuān)項(xiàng)（2010IK013）

李雯雯（1986－），女，廣西南寧人，碩士研究生，主要從事寄生蟲(chóng)分子生物學(xué)及免疫學(xué)研究。