喬立旺，焦培榮，張東霞，李 芳，胡自立，劉海玲，辛朝安，廖 明，羅開健

（華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院 農業(yè)部動物疫病防控重點開放實驗室，廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣東廣州510642）

H5N1亞型高致病性禽流感病毒對鴿的致病性分析

喬立旺，焦培榮△，張東霞，李 芳，胡自立，劉海玲，辛朝安，廖 明，羅開?。?/p>

（華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院 農業(yè)部動物疫病防控重點開放實驗室，廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣東廣州510642）

為評估H5N1亞型禽流感病毒對鴿的致病性，用我國2004年分離的一株H5N1亞型禽流感病毒A/pigeon/GD/C2/2004（H5N1）人工感染4周齡鴿，進行了致病性試驗。結果表明，該株病毒以106EID50/100μL劑量感染能致死鴿，致死率為22.2%，病毒能在感染鴿體內廣泛分布，其中肺臟和腎臟中病毒含量達到104.50EID50/mL，表明該株病毒對鴿具有感染性，且感染鴿未通過喉頭和泄殖腔向外排毒。

禽流感病毒；H5N1；鴿；感染

＊通訊作者

禽流感（Avian influenza，AI）是由A型流感病毒引起的一種禽類的感染/疾病綜合征。該病被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定為必須報告的動物傳染病，我國將其列為一類動物疫?。?］。H5N1亞型高致病性禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）可引起多種禽類感染，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大經濟損失。多種野鳥、家禽（特別是雞和火雞）及野生動物都可感染H5N1亞型高致病性AIV［2－4］。由于野鳥和野生水禽的存在，H5N1亞型AIV可被帶到世界各地，給公共衛(wèi)生造成巨大危害［5］。2002年，香港首次報道在野生鴿體內分離到H5N1亞型AIV［6］，但鴿對H5N1亞型AIV的易感性以及其在禽流感病毒傳播中所起的作用尚未明確。在以往的研究中，不少學者報道鴿對AIV僅有極弱的敏感性或對其具有耐受力［7－10］。然而，最近的研究表明，近年分離到的H5N1亞型AIV可引起鴿的感染發(fā)病，且病毒能在鴿體內復制［11］。

2004年華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院禽病研究室從廣東某養(yǎng)鴿場發(fā)病鴿體內分離到一株H5N1亞型AIV，為了檢測該毒株對鴿的致病性，以點眼滴鼻的途徑人工感染實驗鴿，通過對其在鴿體內臟器中的復制情況以及血清轉化的分析，研究其對鴿的致病性。

1 材料與方法

1.1 實驗室條件

本研究中有關活毒的操作均在3級生物安全（P3）實驗室內進行，動物實驗在P3實驗室的負壓隔離器中進行。

1.2 材料

H5N1 亞 型 禽 流 感 病 毒 A/pigeon/GD/C2/2004（H5N1）由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院禽病研究室分離、鑒定和保存。4周齡未免疫鴿購自江門市翔勝鴿業(yè)有限公司，試驗前用HI試驗檢驗證明無抗H5N1亞型AIV、H9N2亞型AIV和新城疫病毒HI抗體。

1.3 方法

1.3.1 病毒復壯 將 H5N1亞型AIV以1 000倍稀釋，按每枚胚0.1mL的劑量經尿囊腔接種9日齡～11日齡SPF雞胚，置于37℃孵育。將24h～48h內死亡或存活的雞胚置4℃保存12h后，無菌收獲雞胚絨毛尿囊液，分裝，于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 雞胚半數感染量（EID50）的測定 取病毒尿囊液用滅菌PBS做10倍系列稀釋，將105～1010每稀釋度按每胚0.1mL劑量接種5枚雞胚，37℃孵育，將24h～48h內死亡的雞胚置于4℃冰箱保存，37℃孵化48h后測所有死亡和未死胚尿囊液的血凝活性，以判斷其是否感染。按Reed－Muench法計算EID50［12］。

1.3.3 鴿感染試驗 12只4周齡鴿，9只經點眼滴鼻途徑接種106EID50/100μL的含病毒尿囊液，每只100μL，于負壓隔離器中隔離飼養(yǎng)觀察。3只不感染，但與接種病毒的鴿同隔離器、同條件飼養(yǎng)作為同居對照。感染后14d內，每天觀察并記錄試驗鴿的發(fā)病和死亡情況。

1.3.4 病毒在鴿體內的復制和排泄試驗 在試驗鴿接種病毒后第1、3、5、7天，無菌條件下分別采集喉頭拭子和泄殖腔拭子，置于1mL含有雙抗的PBS中。離心取上清，接種9日齡～11日齡雞胚，孵育24h～48h收集尿囊液通過血凝試驗檢測其血凝活性。血凝試驗以常規(guī)方法在96孔板上進行，具體操作程序按照世界動物衛(wèi)生組織（OIE）的標準［12］進行。試驗鴿接種病毒后第3天和第5天，各處死3只試驗鴿，分別采集腦、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、胰、盲腸、氣管和法氏囊等組織，各稱取1g放入滅菌研磨器中，加入含青霉素和鏈霉素的PBS液，制成組織勻漿。轉入滅菌離心管中，離心取上清液做10倍系列稀釋，每個稀釋度接種3枚9日齡～11日齡雞胚，接種劑量每枚胚0.1mL，孵育24h～48 h，收集尿囊液檢測其血凝活性，并計算病毒含量。

1.3.5 感染鴿的血清轉化檢測 于接種病毒后第3天、第5天、第7天和第14天分別采集感染鴿血液，每只0.5mL（死亡鴿在瀕死時采集血液），分離血清后用 A/pigeon/GD/C2/2004（H5N1）為抗原通過血凝抑制試驗檢測其HI抗體。HI試驗在96孔板上進行，根據抗原效價計算4單位抗原量，4單位抗原的配制在冰上操作，具體操作程序按照世界動物衛(wèi)生組織（OIE）的方法進行［12］。

1.3.6 同居鴿的感染發(fā)病記錄及血清轉化檢測

每天觀察并記錄3只同居鴿的發(fā)病情況，并于感染鴿接種病毒后第14天采集同居鴿血液，每只0.5 mL，分離血清后用 A/pigeon/GD/C2/2004（H5N1）為抗原檢測其HI抗體。

2 結果

2.1 感染鴿病死率和發(fā)病癥狀

在14d的感染期內，9只試驗感染鴿中有2只發(fā)病死亡，病死率為22.2%，死亡時間分別為感染后第4天和第11天。感染的9只試驗鴿均有較明顯的臨床癥狀，表現為羽毛逆立，精神萎靡，多數鴿在72h內自愈。感染較重的試驗鴿可見食欲廢絕，站立不穩(wěn)，精神極度沉郁，頭頸歪曲。隨著病情加重，神經癥狀愈加明顯，病鴿呈角弓反張，頭頸震顫，不斷呈轉圈運動。

感染鴿的病理變化：感染后第3天和第5天處死的6只鴿均可見腸道出現明顯的出血壞死，內容物腐敗有惡臭味；感染后第3天的1只鴿的肝組織出現黃白色的條狀壞死灶。第4天和第11天發(fā)病死亡的2只鴿還可觀察到腦膜出血，腦組織液化壞死。

2.2 病毒在鴿體內的復制和排毒測定

第3天處死的3只鴿中，其中1只鴿除胰腺和腸道未分離到病毒外，在腦、氣管、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎和法氏囊中均能分離到H5N1亞型AIV，其中氣管的病毒含量達到103.50EID50/mL。其他2只以及第5天處死的3只鴿子體內未檢測到病毒存在。在感染后第4天發(fā)病死亡的1只鴿體內，從所采集的氣管、心臟、肝臟、肺、腎、胰和腸道中均可分離到H5N1亞型AIV，其中肺和腎的病毒含量達到104.50EID50/mL；感染后第11天死亡的1只鴿體內，從所采集的腦、氣管、心臟、脾臟、肺和腎中分離到H5N1亞型 AIV，其中肺臟病毒含量達到104.25EID50/mL（表1）。本試驗未從感染鴿所有拭子中分離到病毒。

表1 病毒感染鴿后在鴿體內臟器的復制情況Table1 Replication of the H5N1virus in orgens of pigeons

2.3 感染鴿的血清轉化結果

在第3天、第5天和第7天，感染鴿的血清樣品以及第4天死亡的鴿血清樣品中未發(fā)現血清陽轉，第14天的1份血清樣品及第11天死亡的1只鴿的血清樣品，可檢測到血清呈H5亞型HI抗體陽性，HI效價均為3log2（表2）。

2.4 同居鴿的感染情況及血清轉化結果

在14d的感染期內，3只同居鴿均表現正常。采集的喉頭和泄殖腔拭子中，均未分離到H5N1亞型AIV。試驗第14天，3只同居鴿的血清樣品用A/pigeon/GD/C2/2004（H5N1）為抗原進行 HI檢測，也均未發(fā)現血清H5陽性轉化。

表2 感染鴿血清轉化情況Table 2 Seroconversion of infected pigeons

3 討論

以往的研究中，不少學者報道鴿對H5N1亞型AIV僅有極弱的易感性或對其具有耐受力，這種觀點主要基于感染高致病性AIV或低致病性AIV后的鴿不表現明顯的臨床癥狀，病毒不能在鴿體內有效地復制，也 不 能 引 起 感 染 鴿 的 血 清 轉 化［7－8，14，16］。我們的試驗發(fā)現，人工感染所用的H5N1亞型AIV引起試驗鴿表現出較明顯的臨床癥狀。從致病性試驗結果來看，鴿感染病毒后的第3天可在部分鴿體內進行有效地復制；從感染鴿的喉頭和泄殖腔拭子中未能分離到病毒，感染后的第11天、第14天，2只感染鴿血清中檢測為H5亞型AIV抗體陽性，表明本試驗所用的 A/pigeon/GD/C2/2004（H5N1）對試驗鴿有一定致病性。同居試驗鴿的臟器中不能分離到病毒，14d內的血清中也未檢測到H5亞型AIV HI抗體，這說明鴿可能不具備水平傳播H5N1亞型AIV的能力。

Liu Y H等［14］利用2004年－2006年分離到的不同宿主來源的H5N1亞型AIV以較低劑量（5×104EID50）感染鴿，試驗鴿不表現臨床癥狀，也檢測不到病毒復制。Werner O 等［15］用高劑 量 （108.1EID50）的 A/chicken/Indonesia/2003（H5N1）感染成年試驗鴿，感染鴿表現明顯的神經癥狀，病毒可在部分感染鴿的腦、氣管、肺、心臟、脾、腎、腺胃和小腸復制。這說明，H5N1亞型AIV對鴿的致病能力可能受鴿的個體差異、感染劑量、攻毒方式以及外界環(huán)境等因素的影響。

Perkins L E等［16］的報道中認為，野生鴿對A/chicken/Hong Kong/220/97（H5N1）毒株不敏感。Yu Z J等［17］研究認為，家鴿對2004年分離到的H5N1亞型AIV具有感染性，并能從鴿組織，特別是腺胃中分離到病毒。賈貝貝［11］研究發(fā)現，鴿對近年分離到的不同源性的H5N1亞型AIV具有敏感性。這些研究說明，不同H5N1亞型AIV毒株對鴿的致病能力不同。通過分析這些病毒的基因序列，利用反向遺傳技術等分子生物學手段，可望從分子水平上揭示不同H5N1亞型AIV對鴿致病性差異的原因。

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Pathogenicity of H5N1 Highly Pathogenic Avian Influenza Virus in Pigeons

QIAO Li－wang，JIAO Pei－rong，ZHANG Dong－xia，LI Fang，HU Zi－li，LIU Hai－ling，XIN Chao－an，LIAO Ming，LUO Kai－jian
（KeyLaboratoryofZoosisDiseaseControlandPreventionofGuangdongProvince/KeyLaboratoryofAnimal DiseaseControlandPreventionoftheMinistryofAgriculture/CollegeofVeterinaryMedicine，South ChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou，Guangdong，510642，China）

To evaluate the pathogenicity of H5N1subtype Avian influenza viruse（AIV）in pigeons，4－weekold pigeons were infected artificially with A/pigeon/GD/C2/2004（H5N1）which isolated from China in 2004.The results showed that the pigeons could be killed with 106EID50/100μL dose of virus and the lethality was 22.2%.The virus could be isolated from nearly all organs of the infected pigeons，especially in the lung and the kidney reaching titers of 104.50EID50/mL.The result showed H5N1AIV had the pathogenicity to pigeons.Besides，we found that all the infected pigeons have not shed virus via the oropharynx and the cloaca.

Avian influenza virus；H5N1；pigeons；infection

S852.659.5

A

1007－5038（2011）10－00015－04

2011－01－29

教育部創(chuàng)新團隊項目（IRT0723）；國家肉雞產業(yè)技術體系項目（nycytx－42－G3－03）；廣東省自然科學基金項目（10151064201000021，10251064201000004）；廣東省科技計劃項目（2010B020307005）

喬立旺（1982－），男，山東濟寧人，碩士研究生，主要從事動物病毒分子生物學及動物傳染病防控研究。△對本文貢獻與第一作者相同，