于建立，白 雪，劉國(guó)興，吳秀萍，王學(xué)林，劉明遠(yuǎn)

（吉林大學(xué)人獸共患病研究所 吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062）

旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶對(duì)S774A.1巨噬細(xì)胞的毒性作用

于建立，白 雪，劉國(guó)興，吳秀萍，王學(xué)林，劉明遠(yuǎn)＊

（吉林大學(xué)人獸共患病研究所 吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062）

為探究旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)排泄分泌抗原（ES）中絲氨酸蛋白酶對(duì)宿主免疫調(diào)節(jié)作用，用PCR擴(kuò)增出旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)期特異性絲氨酸蛋白酶基因Zh68，克隆至表達(dá)載體pET28a，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21（DE3），經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的重組蛋白免疫接種動(dòng)物獲取抗血清。將抗體封閉前后的ES分別作用于S774A.1巨噬細(xì)胞，CCK－8檢測(cè)巨噬細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ES可以抑制S774A.1細(xì)胞增殖，并促使其出現(xiàn)凋亡趨勢(shì)。但用Zh68多抗封閉ES后，這種作用減弱。證實(shí)了旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)ES中的絲氨酸蛋白酶可以抑制巨噬細(xì)胞增殖，促巨噬細(xì)胞出現(xiàn)凋亡趨勢(shì)，從而為旋毛蟲(chóng)的侵襲與生存提供了有利的環(huán)境。

旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)；排泄分泌抗原；絲氨酸蛋白酶；巨噬細(xì)胞；毒性作用

＊通訊作者

旋毛蟲(chóng)病是一種重要的人獸共患寄生蟲(chóng)病，由誤食含有旋毛蟲(chóng)感染性肌幼蟲(chóng)的生的或半生的肉類引起。旋毛蟲(chóng)感染可以有效干擾宿主免疫，下調(diào)宿主炎性應(yīng)答，致使宿主出現(xiàn)免疫抑制［1－2］。但由于旋毛蟲(chóng)抗原的復(fù)雜性，參與這種抑制作用的抗原分子及其機(jī)制仍不明確。吉林大學(xué)人獸共患病研究所食源性寄生蟲(chóng)病實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建旋毛蟲(chóng)3日齡成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)并免疫篩選獲得一高豐度和強(qiáng)抗原性的絲氨酸蛋白酶基因［3］。對(duì)該陽(yáng)性克隆Zh68序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其具有信號(hào)肽［4］，是旋毛蟲(chóng)排泄分泌抗原（excretory－secretory antigens，ES）的重要成員。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上，對(duì)該絲氨酸蛋白酶的生物學(xué)功能進(jìn)一步研究，以探討其在排泄分泌抗原中調(diào)控宿主免疫應(yīng)答的重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

EcoRⅠ、XhoⅠ、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、IPTG為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒DNA快速制備試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒為杭州維特潔生化試劑公司產(chǎn)品；原核表達(dá)載體pET－28a，BL21（DE3）為 Novagen公司產(chǎn)品；pBluescript－Zh68質(zhì)粒和旋毛蟲(chóng)感染保種大鼠由吉林大學(xué)人獸共患病研究所食源性寄生蟲(chóng)病實(shí)驗(yàn)室提供；S774A.1巨噬細(xì)胞細(xì)胞由吉林大學(xué)劉波教授惠贈(zèng)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 pET－28a－Zh68重組質(zhì)粒構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) 以pBluescript－Zh68質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)特異性上下游引物，Zh68－F：5′－CC GAA TTC ATT TCA GGA GGC TCT－3′（含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），Zh68－R：5′－TAA TAC GAC TCA CTA TAG G－3′（T7通用引物）。PCR擴(kuò)增的Zh68基因和pET－28a載體分別用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)菌BL21（DE3）。將陽(yáng)性重組子單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中（卡那霉素100μg/mL），37℃震蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.6時(shí)，加入IPTG使其終濃度為1mmol/L，37℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別誘導(dǎo)1、2、3、4、5h后收集菌體，超聲破碎，進(jìn)行SDS－PAGE檢測(cè)。切下目的蛋白帶放入透析袋中。120V電泳洗脫2h，置于裝有500mL PBS燒杯中，4℃過(guò)夜透析。采用紫外分光光度法計(jì)算蛋白含量，保存于－20℃待用。

1.2.2 Zh68多克隆抗體的制備 純化后的重組蛋白500μg與完全弗氏佐劑（FCA）等體積混合乳化皮下注射日本大耳白兔，每隔2周用純化的蛋白與不完全弗氏佐劑（FIA）等體積乳化后加強(qiáng)免疫2次后，心臟采血分離血清，并用飽和硫酸銨沉淀法純化抗體，用雙向瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)其效價(jià)。

1.2.3 旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)期ES收集 保種Wistar大鼠處死后胴體用人工消化液（含10g/L胃蛋白酶和10 mL/L濃鹽酸）37℃消化2h，過(guò)篩并反復(fù)沉降清洗獲取感染性肌幼蟲(chóng)，計(jì)數(shù)后每只wistar大鼠灌胃感染8 000條肌幼蟲(chóng)。于感染后3d剖殺大鼠，取腸收集成蟲(chóng)，并用IMDM培養(yǎng)液（含有青霉素100單位/mL，鏈霉素100單位/mL）于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，收集上清作為ES備用。

1.2.4 細(xì)胞毒性分析及流式細(xì)胞分析 96孔板接種S774A.1細(xì)胞（3×104個(gè)/孔）加入成蟲(chóng)ES，濃度分別達(dá)到25、12.5、6.25、3.125、1.56μg/mL，于CO2培養(yǎng)箱中處理4、8、12、24h，加CCK－8溶液孵育3h后，在酶標(biāo)儀450nm處檢測(cè)吸光度。將ES與不同量的Zh68多抗于37℃水浴中處理1h后加入S774A.1細(xì)胞中，孵育24h后，再次用CCK－8檢測(cè)。計(jì)算細(xì)胞存活率＝（試驗(yàn)組－空白孔）吸光度值/（PBS組－空白孔）吸光度值。將上述處理的細(xì)胞用Annexin－V和PI染色后，上細(xì)胞流式儀檢測(cè)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)＋標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用最小顯著差（LSD）法。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增和EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后得到目的片段，且長(zhǎng)度與設(shè)計(jì)長(zhǎng)度相符，測(cè)序結(jié)果與原序列相同（圖1）。重組表達(dá)質(zhì)粒pET－28a－Zh68構(gòu)建成功，可以用于表達(dá)。

圖1 重組質(zhì)粒pET－28a－Zh68鑒定Fig.1 Identification of pET－28a－Zh68

2.2 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)及Zh68多抗制備

SDS－PAGE 檢 測(cè) 顯 示 重 組 菌 pET－28a－Zh68 BL21（DE3）與非重組菌pET－28a相比在47ku處出現(xiàn)了一條新的表達(dá)條帶，該條帶的分子質(zhì)量大小與理論推導(dǎo)值相符。而0h誘導(dǎo)及誘導(dǎo)前后非重組的pET－28a對(duì)照菌均無(wú)特異性蛋白帶（圖2）。誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白經(jīng)切膠電洗脫純化后成份較純，不含有大腸埃希菌成分（圖3）。將純化蛋白免疫接種動(dòng)物后獲得的抗血清用飽和硫酸銨沉淀法純化，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)其效價(jià)為1∶8。

圖2 重組質(zhì)粒pET－28a－Zh68表達(dá)產(chǎn)物SDS－PAGE結(jié)果Fig.2 SDS－PAGE of expression products of pET－28a－Zh68

圖3 重組蛋白純化后SDS－PAGE結(jié)果Fig.3 The results of SDS－PAGE of purified recombination protein

2.3 細(xì)胞毒性分析

收集的ES經(jīng)透析濃縮后測(cè)定蛋白濃度為350 μg/mL，25、12.5 、6.25、3.125、1.56μg/mL濃度的ES作用24h后，相對(duì)于PBS組，S774A.1細(xì)胞增殖均不同程度受到抑制（圖4），表明ES以劑量依賴性方式抑制S774A.1細(xì)胞的增殖。ES作用細(xì)胞時(shí)間的長(zhǎng)短也在一定程度上影響其對(duì)S774A.1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制水平（圖5）。ES經(jīng)Zh68多抗封閉后毒性作用減弱（圖6），當(dāng)兩者比例達(dá)到1∶5后細(xì)胞存活率達(dá)到最高，之后不再上升，與PBS組對(duì)比仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。

2.4 流式細(xì)胞分析

我們通過(guò)Annexin V和PI雙標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了ES在明顯抑制S774A.1細(xì)胞增殖的濃度（12.5μg/mL）作用下巨噬細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，作用24h后，細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡，但是加入絲氨酸蛋白酶Zh68多抗預(yù)處理后，這種凋亡趨勢(shì)降低（圖7）。

圖4 不同ES濃度對(duì)S774A.1細(xì)胞的影響Fig.4 The effect of ES at different concentrations on S774A.1cells

圖5 不同ES作用時(shí)間對(duì)S774A.1細(xì)胞的影響Fig.5 The effect of ES at different acting time on S774A.1cells

圖6 與不同比例多克隆抗體共孵育后ES對(duì)S774A.1細(xì)胞的影響Fig.6 The effect of ES which incubated with Zh68antibody at different proportion on S774A.1cells

圖7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)S774A.1細(xì)胞凋亡結(jié)果Fig.7 Determination of apoptosis of S774A.1macrophages by FCM

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)的重要成員，它可以非特異性吞噬殺傷多種病原微生物，與粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞等共同構(gòu)成了機(jī)體的快速免疫反應(yīng)機(jī)制。同時(shí)巨噬細(xì)胞在機(jī)體后天獲得性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和發(fā)展方向上起到了重要作用，它可以通過(guò)自身的經(jīng)典激活通路［5］或選擇性激活通路［6－7］來(lái)調(diào)控宿主的Th1和Th2型免疫應(yīng)答。Marta K S等［8］發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞及其產(chǎn)物NO、O2－等與旋毛蟲(chóng)感染小鼠免疫反應(yīng)密切相關(guān)。鑒于巨噬細(xì)胞在宿主免疫系統(tǒng)中重要作用，本研究選取小鼠S774A.1巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)絲氨酸蛋白酶多抗封閉前后ES對(duì)S774A.1細(xì)胞影響作用的對(duì)比，來(lái)探討旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)ES中絲氨酸蛋白酶對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的影響。傳統(tǒng)上對(duì)寄生蟲(chóng)抗原的分子研究常常采用原核或真核表達(dá)目的蛋白的方式來(lái)進(jìn)行，但前者表達(dá)蛋白無(wú)活性，后者蛋白表達(dá)量低下，所以本研究采用體外培養(yǎng)旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)收集排泄分泌抗原來(lái)獲取較大量的有天然活性的絲氨酸蛋白酶。但是該ES除了絲氨酸蛋白酶外還有其他復(fù)雜的成分，所以本研究用原核表達(dá)絲氨酸蛋白酶免疫動(dòng)物獲取絲氨酸蛋白酶多克隆抗體，通過(guò)抗體封閉作用來(lái)調(diào)控相同復(fù)雜背景下絲氨酸蛋白酶的存在與缺失。

通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ES可以明顯抑制S774A.1細(xì)胞增殖，并促使其出現(xiàn)凋亡趨勢(shì)。但用成蟲(chóng)期絲氨酸蛋白酶多克隆抗體封閉后的ES毒性作用降低，這說(shuō)明成蟲(chóng)期絲氨酸蛋白酶在ES對(duì)抑制巨噬細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡過(guò)程中起到了重要作用。絲氨酸蛋白酶廣泛存在于寄生性蠕蟲(chóng)分泌物中，在蠕蟲(chóng)的生活史及致病機(jī)制中起到了重要作用。例如，布魯絲蟲(chóng)可分泌絲氨酸蛋白酶滅活補(bǔ)體C5a，從而抑制宿主外周末梢血液中粒細(xì)胞的趨化性［9］；曼氏血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)通過(guò)自身分泌的絲氨酸蛋白酶降解免疫球蛋白IgE，從而抑制宿主免疫應(yīng)答［10］。Todotova V K等［11－12］在對(duì)旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)ES中蛋白酶成分及活性檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)了具有顯著作用的絲氨酸蛋白酶，并隨后對(duì)其進(jìn)行親和層析純化，鑒定其具有強(qiáng)抗原性，可被旋毛蟲(chóng)感染小鼠血清所抑制活性。但絲氨酸蛋白酶究竟在旋毛蟲(chóng)致病機(jī)制中起到什么作用卻未闡明。Barriga O O 等［13］及Faubert G M 等［14］通過(guò)大量研究結(jié)果和試驗(yàn)現(xiàn)象，認(rèn)為旋毛蟲(chóng)對(duì)感染宿主機(jī)體的免疫抑制僅發(fā)生在成蟲(chóng)和新生幼蟲(chóng)階段的侵襲期。作為旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)ES中最重要成員，絲氨酸蛋白酶在宿主免疫抑制中的作用就不容忽視。本試驗(yàn)證實(shí)了旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)ES中絲氨酸蛋白酶對(duì)巨噬細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用，為旋毛蟲(chóng)侵襲宿主提供了有利的環(huán)境。另有研究表明，包括旋毛蟲(chóng)在內(nèi)的線蟲(chóng)ES可以抑制樹(shù)突狀細(xì)胞成熟［15－16］，從而發(fā)揮免疫抑制作用，而巨噬細(xì)胞同樣作為一種重要的抗原遞呈細(xì)胞，其增殖受到抑制和出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象也可間接說(shuō)明感染旋毛蟲(chóng)宿主的免疫抑制現(xiàn)象。本研究為旋毛蟲(chóng)病防治的關(guān)鍵和準(zhǔn)確分子靶標(biāo)的確定奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Toxicity of Serine Ptotease of Adult
Trichinellaspiralison S774A.1 Macrophages

YU Jian－li，BAI Xue，LIU Guo－xing，WU Xiu－ping，WANG Xue－lin，LIU Ming－yuan

（InstituteofZoonoses，CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，JilinUniversity，Changchun，Jilin，130062，China）

To investigate the effect of serine protease in excretory－secretory antigens（ES）antigens of adultTrichinellaspiralison the host＇s immune system，full length sequence of serine protease gene Zh68was amplified by PCR.The PCR products was cloned into pET28avector，and the positive recombinant plasmid was transformed intoEscherichiacoliBL21（DE3）.The Zh68antibody was acquired form the rabbit by immunization with recombinant Zh68protein.ES or ES treated by Zh68antibody were incubated with S774A.1macrophages.The number of S774A.1macrophages was calculated by CCK－8，and the apoptotic rate was determined by flow cytometry （FCM）.The results showed that ES antigens ofTrichinella spiraliscan inhibit the proliferation of macrophages and promote the apoptosis of S774A.1macrophages.However，this effect was significantly decreased when ES antigens were treated by Zh68antibody.We demonsrtated that serine protease in ES antigens ofTrichinellaspiraliscan inhibit the proliferation of macrophages and promote apoptosis of macrophages.

adultTrichinallespiralis；excretory－secretory antigen；serine protease；macrophage；toxicit y

S852.33

A

1007－5038（2011）10－0005－05

2011－04－01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31030064）；國(guó)家杰出青年科學(xué)基金項(xiàng)目（30825033）

于建立（1985－），男，山東煙臺(tái)人，碩士，主要從事獸醫(yī)公共衛(wèi)生工作。