周志剛 廖建平 傅江明 李強(qiáng) 嚴(yán)朝華 蔡亮

骨肉瘤是一種相對(duì)耐藥的腫瘤，單藥化療的效果一直不很理想。聯(lián)合化療多以鉑類藥物為主。TRAIL是INF超家族成員，能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)旨在探討TRAIL與鉑類藥物聯(lián)合化療方案的可行性，為骨肉瘤的臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 HOS-8603細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所;TRAIL、順鉑、CsA均購(gòu)自Sigma公司(化學(xué)純標(biāo)準(zhǔn)品)。主要器材:流式細(xì)胞儀 型號(hào):EPICS ALTRAⅡ.American Beckman;熒光酶標(biāo)儀 型號(hào):GENIOS VA200，AUSTRIA TECAN。

1.2 藥物配制 將TRAIL用生理鹽水溶解并分別配制成10ug/ml和50ug/ml兩種濃度的儲(chǔ)藏液。將順鉑、CsA分別用生理鹽配制成10ug/ml的儲(chǔ)藏液，備用。

1.3 凋亡細(xì)胞熒光染色 HOS-8603細(xì)胞以1×106接種于六孔板培養(yǎng)，加入不同濃度的TRAIL+順鉑，培養(yǎng)24 h后，經(jīng)DHanks液洗滌及熒光染料Hoechst33258和PI，37℃避光染色10 min，洗滌后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及顏色改變。

1.4 透射電鏡觀察 1000 r/min，離心10 min收集處理后的HOS-8603細(xì)胞，經(jīng)固定、脫水、包被及乙酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙染色處理后透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5 MTT法測(cè)定TRAIL，順鉑，TRAIL+順鉑對(duì)HOS-8603細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HOS-8603細(xì)胞，以2×106/ml的細(xì)胞濃度，接種于上述三種藥物處理培養(yǎng)基中，以生理鹽水為空白對(duì)照組。將每種藥物組分兩組，其中一組在加藥物前30 min加入終濃度1.0 μg/mlCsA［10，11］，每組設(shè) 3 個(gè)平行對(duì)照孔。

1.6 細(xì)胞DNA含量分布測(cè)定 取藥物處理12，24，36，48 h后HOS-8603細(xì)胞，經(jīng)固定、染色后流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA。

1.7 細(xì)胞ΔΨm檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［1，2］，取上述三種藥物處理12，24，36，48 h后的HOS-8603細(xì)胞，經(jīng)DHanks液洗滌后用10ug/ml Rh123在37℃避光染色30 min，再次洗滌后用10ug/ml PI在37℃避光染色20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包作方差分析對(duì)各組作顯著性檢驗(yàn)，TRAIL組與TRAIL加CsA組采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOS-8603細(xì)胞分別經(jīng)2.5 ug/ml TRAIL，1.0 ug/ml順鉑，2.5μg/ml TRAIL+1.0μg/ml順鉑作用后，都出現(xiàn)了明顯的凋亡峰，亞G1期細(xì)胞百分率分別為29.3%，57%，83%。聯(lián)合用藥組明顯高于單一用藥組(P＜0.01)。

2.2 在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞核呈彌散均勻熒光，出現(xiàn)凋亡時(shí)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)濃染致密顆粒塊狀熒光。如圖1示。

圖1 比較兩圖中的同一細(xì)胞高藍(lán)/低紅為凋亡細(xì)胞;低藍(lán)/高紅為壞死細(xì)胞;低藍(lán)/低紅為正常細(xì)胞。

2.3 HOS-8603細(xì)胞經(jīng)2.5ug/ml TRAIL+1.0 ug/ml順鉑作用12 h后，倒置顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞體積縮小，開(kāi)始呈圓形，以細(xì)胞表面起泡，變成不規(guī)則形狀。緊鄰細(xì)胞之間出現(xiàn)空虛，有離群，脫落感。透射電鏡下見(jiàn)凋亡細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的濃縮，形成染色質(zhì)塊，并集聚在核的邊緣，呈半月形，花瓣?duì)罨撞烤o貼核膜。胞質(zhì)凝縮，最后核斷裂，細(xì)胞通過(guò)出芽的方式形成許多凋亡小體，其外有完整的膜封閉，其內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器，還有凝縮的染色體;線粒體腫脹，空泡狀，外膜破裂，內(nèi)膜脹大呈氣球狀，脊消失。如圖3所示。

圖2 A 染色質(zhì)濃縮，形成染色質(zhì)塊，并邊聚在核的邊緣，呈半月形，花瓣?duì)睿撞烤o貼核膜。

圖2 B 線粒體腫脹，空泡化，內(nèi)膜腫大呈氣球狀，脊消失。胞質(zhì)間可見(jiàn)早期凋亡小體。

2.4 經(jīng)TRAIL+順鉑和TRAIL+順鉑+CsA處理后的細(xì)胞ΔΨm變化如表2所示;TRAIL+順鉑組的Rh123-PI-細(xì)胞百分率均明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.01)。表明在胞膜完整的情況下，TRAIL+順鉑能引起ΔΨm下降(P＜0.01);TRAIL+順鉑作用前加入CsA后，Rh123-PI-細(xì)胞百分率明顯降低(P＜0.01)，但仍高于空白對(duì)照組(P＜0.01)。

2.5 TRAIL+順鉑作用于HOS-8603細(xì)胞后Rh123-PI-與亞G1期細(xì)胞百分率間有直線相關(guān)關(guān)系(r=0.998，P＜0.01)，即凋亡細(xì)胞百分率越高，ΔΨm下降細(xì)胞百分率越高。

3 討論

聯(lián)合化療是目前提高骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性的研究熱點(diǎn)。本研究中TRAIL+順鉑的MTT法測(cè)定抑制率為58.5%。明顯優(yōu)于兩者單用(P＜0.01)，說(shuō)明在骨肉瘤化療中順鉑和TRAIL有協(xié)同作用，能增強(qiáng)骨肉瘤對(duì)化療的敏感性，并且順鉑的使用劑量明顯減少。

亞G1期細(xì)胞出現(xiàn)是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志之一。本研究中我們采用了TRAIL、順鉑，TRAIL+順鉑分別作用于HOS-8603細(xì)胞后測(cè)定亞G1期細(xì)胞百分率，結(jié)果顯示TRAIL+順鉑組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用顯著高于TRAIL組和順鉑組(P＜0.01)。表明TRAIL+順鉑的聯(lián)合化療方案可能提高骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性。

近年來(lái)研究證實(shí)，線粒體在細(xì)胞凋亡控制中起決定性作用［3，4］線粒體的早期改變?yōu)?線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(MPTP)開(kāi)放，釋放線粒體內(nèi)凋亡相關(guān)物質(zhì)，這些物質(zhì)激活Caspase-9酶系，從而引發(fā)連鎖反應(yīng)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MPTP是跨膜多蛋白孔，可能由電壓依賴的陰離子通道(VDAC)-腺苷酸移位酶-親環(huán)蛋白-D(CyP-D)三聯(lián)復(fù)合物構(gòu)成［5-8］。在正常情況下MPTP只允許質(zhì)子等分子量較小的物質(zhì)通過(guò)線粒體膜，形成穩(wěn)定ΔΨm。MPTP開(kāi)放可導(dǎo)致ΔΨm下降或喪失，因此，可通過(guò)檢測(cè)ΔΨm觀察線粒體的改變［9-11］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)TRAIL和順鉑處理后的HOS-8603細(xì)胞ΔΨm隨藥物作用時(shí)間的增加而下降，并且與線粒體超微結(jié)構(gòu)改變相一致。

順鉑和TRAIL聯(lián)合化療既增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對(duì)其化療的敏感性，又減少了順鉑的使用劑量。我們相信TRAIL和順鉑的聯(lián)合化療方案會(huì)有很廣闊的臨床應(yīng)用前景。由于體外細(xì)胞株培養(yǎng)不能模仿體內(nèi)三維結(jié)構(gòu)，不能準(zhǔn)確反映藥物-人體-腫瘤的復(fù)雜關(guān)系，且腫瘤具有一定的異質(zhì)性。因此只能從實(shí)驗(yàn)的角度來(lái)肯定聯(lián)合應(yīng)用順鉑和TRAIL，能取得比單獨(dú)應(yīng)用順鉑或TRAIL更明顯的對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒性作用，為臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但進(jìn)一步的結(jié)果尚需更深入的研究。

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