陳松旺，周云，孟凡榮，趙美麗

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院超聲科，江蘇 南京 210006

兔VX2肝癌模型的建立，常用開(kāi)腹與超聲引導(dǎo)下穿刺接種法，穿刺法較開(kāi)腹接種法損傷小、并發(fā)癥少，被國(guó)內(nèi)大多數(shù)研究者采用。本研究采用開(kāi)腹和超聲引導(dǎo)下深植入法和淺植入法建立兔肝VX2腫瘤模型，比較2種接種方法的腫瘤接種成功率和異位種植率，尋找更為合適的超聲引導(dǎo)下穿刺種植建模方法。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

選取健康新西蘭白兔80只（南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供），體重2.0～2.5kg，雌雄不限。兔VX2腫瘤組織由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。組織塊接種采用14G穿刺針（日本八光），組織塊懸液接種采用18G穿刺針（日本八光）。3%戊巴比妥鈉1mL/kg，耳緣靜脈注射麻醉。明膠海綿（南京金陵制藥廠生產(chǎn))預(yù)先剪碎備用，每塊大小1mm3。Philips HDI5000 型彩色多普勒超聲診斷儀,探頭頻率為5~12MHz。

1.2 荷瘤兔制作方法

將凍存的VX2腫瘤組織塊復(fù)蘇后，在超凈臺(tái)內(nèi)用PBS液沖洗組織塊3遍，用眼科剪將組織塊剪成大小約1mm3的瘤粒，用配有18G針頭的1mL注射器抽吸1mL瘤粒懸浮液，注入兔后腿外側(cè)肌肉內(nèi)，2周后于接種部位可捫及實(shí)質(zhì)性包塊，即制成荷瘤兔。第1只荷瘤兔制作成功后，可取其部分瘤組織，按上述方法制作第2只荷瘤兔。

1.3 腫瘤組織塊及組織塊懸液制備

取荷瘤兔1只，瘤塊所在側(cè)大腿部位備皮消毒，耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1mL/kg）麻醉后，剪開(kāi)并分離局部皮膚及皮下組織，剝離腫瘤，將腫瘤完整取出。

1.3.1 腫瘤組織塊的制備

用眼科剪將腫瘤邊緣灰白色魚(yú)肉樣組織，剪成約1mm×1mm×3mm大小的瘤塊備用。

1.3.2 腫瘤組織塊懸液的制備

用眼科剪將腫瘤組織塊剪成大小約1mm3的微塊，用18G的穿刺針接上1mL注射器抽吸帶有腫瘤組織塊和細(xì)胞懸液的生理鹽水約1mL備用。

1.4 腫瘤肝內(nèi)接種方法

健康新西蘭大白兔80只，隨機(jī)分為開(kāi)腹組及超聲組（每組40只）。開(kāi)腹組及超聲組再分為組織塊組20只（其中，淺植入法10只，深植入法10只）。

腫瘤接種方法如下：

1.4.1 腫瘤組織塊組

實(shí)驗(yàn)兔術(shù)前禁食8h以上，麻醉成功后，仰臥位固定于兔臺(tái)上，手術(shù)常規(guī)剪毛，消毒鋪巾。開(kāi)腹組：自劍突下偏左側(cè)切開(kāi)20mm的切口，鈍性分離后，暴露肝臟。用生理鹽水濕紗布輕柔地將兔肝左葉拉出體外，14G穿刺針穿入預(yù)設(shè)深度肝左葉實(shí)質(zhì)內(nèi)，固定針鞘，拔出針芯，用眼科鑷夾將1塊剪碎的瘤塊放入針鞘內(nèi)，用平頭針芯將瘤塊推入肝內(nèi)，重復(fù)2~3次；再用平頭針芯將1塊明膠海綿推入肝內(nèi)，重復(fù)1~2次，確定接種成功后拔出穿刺針，局部壓迫片刻止血，確認(rèn)無(wú)出血后回納肝臟。切口縫合后碘伏消毒，待兔蘇醒后送回兔籠觀察。超聲組：不需開(kāi)腹，超聲掃查兔左肝，確定穿刺點(diǎn)，在超聲引導(dǎo)下用14G穿刺針穿入預(yù)設(shè)深度肝左葉實(shí)質(zhì)內(nèi)，固定針鞘，拔出針芯，以下操作同上。種植結(jié)束后退出穿刺針。

1.4.2 腫瘤組織塊懸液組

操作同1.4.1，抽取腫瘤組織塊懸液1mL，開(kāi)腹及超聲導(dǎo)引下穿刺，將懸液注入預(yù)設(shè)深度肝左葉實(shí)質(zhì)內(nèi)。

接種完成后，連續(xù)3d肌注青霉素5萬(wàn)U/kg，慶大霉素2.5mg/kg(或 0.25 萬(wàn) U/kg )。

1.4.3 腫瘤種植深度預(yù)設(shè)

淺植入組：穿刺針穿刺進(jìn)入兔肝左葉深度≤20mm。深植入組：穿刺針穿刺進(jìn)入兔肝左葉深度>20mm。

1.5 觀察指標(biāo)

各組分別于接種術(shù)后第1周、2周、3周行超聲檢查，對(duì)兔肝腫瘤的形態(tài)、大小、內(nèi)部回聲及瘤體血供進(jìn)行觀察，并于3周后處死動(dòng)物，剖腹觀察腫瘤在肝內(nèi)生長(zhǎng)情況及腹腔和腹壁異位種植情況。剖開(kāi)腫瘤，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)HE染色觀察腫瘤的組織學(xué)特征。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理, 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，兩兩比較用t檢驗(yàn)。各組異位種植率的比較，用x2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤肝內(nèi)接種生長(zhǎng)及異位種植

2.1.1 腫瘤肝內(nèi)接種生長(zhǎng)

本實(shí)驗(yàn)80只兔，開(kāi)腹及超聲引導(dǎo)下造模，接種后超聲觀察均可見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)，成模率均為100%。

2.1.2 異位種植

組織塊深植入組：開(kāi)腹組及超聲組均無(wú)異位種植。組織塊淺植入組：開(kāi)腹組無(wú)異位種植，超聲組1例腹腔種植。組織塊懸液深植入組：開(kāi)腹組無(wú)異位種植，超聲組2例腹腔種植。組織塊懸液淺植入組：開(kāi)腹組2例腹腔種植；超聲組5例腹腔種植，其中1例同時(shí)腹腔和腹壁種植。腹腔種植兔腹腔內(nèi)可見(jiàn)血性腹水。經(jīng)x2檢驗(yàn)：超聲組組織塊懸液淺植入法較開(kāi)腹組組織塊深植入法和淺植入法、組織塊懸液組深植入法，超聲組組織塊深植入法異位種植率高（P<0.05），余組間異位種植率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）,見(jiàn)表1。

2.2 接種后肝內(nèi)腫瘤大小

3周后超聲測(cè)量腫瘤大小，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示：開(kāi)腹組及超聲組組織塊組腫瘤體積明顯大于組織塊懸液組。組織塊組腫瘤大小明顯大于組織塊懸液組。組織塊深植入組腫瘤大小與淺植入組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組織塊懸液深植入組腫瘤大小與淺植入組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。

2.3 腫瘤的超聲檢查

超聲檢查兔肝左葉或異位種植的腹腔或腹壁，可探及圓形或類圓形低至中等回聲結(jié)節(jié)， 無(wú)包膜，邊界欠清楚，周邊無(wú)低回聲暈。當(dāng)腫瘤內(nèi)出現(xiàn)部分壞死時(shí)，可見(jiàn)部分無(wú)回聲區(qū)（如圖1所示）。彩色多普勒檢查，可見(jiàn)腫瘤周邊及內(nèi)部血流信號(hào)，以周邊血供為主，中央血供少，呈星點(diǎn)狀、短條狀，頻譜多普勒可引出動(dòng)脈樣血流信號(hào)及靜脈樣血流信號(hào)（如圖2所示）。

圖1 種植兔肝左葉腫瘤二維圖像

圖2 兔肝左葉腫瘤彩色及頻譜多普勒?qǐng)D像

2.4 腫瘤的肉眼及病理特點(diǎn)

圖3 兔肝左葉腫瘤病理（低倍鏡下：10×）

圖4 兔肝左葉腫瘤病理（高倍鏡下：40×）

表1 組織塊組與組織塊懸液組

腫瘤在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)呈結(jié)節(jié)狀，無(wú)包膜。腫瘤結(jié)節(jié)呈灰白色，魚(yú)肉樣，質(zhì)硬，其內(nèi)可見(jiàn)豐富的供瘤血管。光鏡下:低倍鏡下正常肝組織內(nèi)見(jiàn)多灶浸潤(rùn)性癌巢，與正常肝實(shí)質(zhì)分界清楚（如圖3所示）。高倍鏡下瘤細(xì)胞呈條索狀或腺樣排列，細(xì)胞呈多邊形，胞質(zhì)較豐富，核圓形或卵圓形，異型明顯并可見(jiàn)核分裂象，瘤組織間壞死明顯（如圖4所示）。

3 討論

3.1 兔VX2肝癌動(dòng)物模型

兔VX2肝癌動(dòng)物模型腫瘤細(xì)胞株起源于Shope病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤衍生的鱗癌，經(jīng)過(guò)72次移植傳代后正式建立株，命名為VX2[1]。它可接種在兔的肝臟、腎臟、肌肉等處。病理學(xué)上腫塊為實(shí)體瘤，浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，血供豐富，可見(jiàn)巨大腫塊并瘤周子灶形成，類似于巨塊型肝癌。該模型制作簡(jiǎn)便易行，價(jià)格相對(duì)低廉，實(shí)驗(yàn)周期短[2]。該模型類似人的肝細(xì)胞肝癌，常將其用于肝癌診斷、治療的基礎(chǔ)研究[3-4]。

3.2 兔VX2肝癌接種

兔VX2肝癌接種方法主要有瘤細(xì)胞懸液接種法和開(kāi)腹瘤塊包埋接種法[5-6]。早期多采用細(xì)胞懸液法制作VX2腫瘤模型，但其費(fèi)用高、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、種植成功率低，易發(fā)生轉(zhuǎn)移和針道種植。開(kāi)腹瘤組織塊種植法雖然其方法簡(jiǎn)單、成瘤率高、模型性質(zhì)穩(wěn)定，但每次接種耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受手術(shù)創(chuàng)傷較大，易發(fā)生術(shù)后感染、粘連、腫瘤壞死。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，超聲引導(dǎo)下穿刺組織塊法及組織塊懸液法接種腫瘤，方法簡(jiǎn)便、可行，創(chuàng)傷小，接種腫瘤成功率高，可取代剖腹手術(shù)肝腫瘤接種。但該方法在接種時(shí)以超聲引導(dǎo)下組織塊法深植入法為首選，其次為超聲引導(dǎo)下組織塊淺植入法及超聲引導(dǎo)下組織塊懸液法深植入法，不推薦使用超聲引導(dǎo)下組織塊懸液法植入法。組織塊法與組織塊懸液法相比，組織塊組腫瘤明顯大于組織塊懸液組。分析其原因可能是植入的組織塊懸液由于注射器推注的壓力，部分液體逆流到腹腔或腹壁，含瘤細(xì)胞的懸液不能全部聚集于肝左葉穿刺部位，同時(shí)組織塊懸液經(jīng)稀釋后細(xì)胞數(shù)減少，導(dǎo)致穿刺部位瘤細(xì)胞總量及聚集范圍變少。

3.3 異位種植發(fā)生的原因

腫瘤種植成功的判斷:在肝內(nèi)接種部位出現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)，無(wú)鄰近器官、腹腔及腹壁種植者視為該腫瘤原位種植成功。不論肝內(nèi)接種部位有無(wú)發(fā)現(xiàn)腫瘤，在鄰近肝臟的其他臟器、腹壁或腹腔內(nèi)出現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)者則視為該接種腫瘤異位種植。本研究中，開(kāi)腹組組織塊懸液淺植入組、超聲組組織塊淺植入組及組織塊懸液深淺植入組都出現(xiàn)了異位種植。異位種植的原因[7-8]:① 經(jīng)穿刺針道逆流滲漏出的腫瘤細(xì)胞流到腹腔或腹壁；② 穿刺接種過(guò)程中穿刺針及針芯將腫瘤組織塊及液體帶出肝組織至腹腔或腹壁；③ 穿刺種植點(diǎn)離肝葉表面較淺，組織塊及其液體被擠出肝組織到腹腔或腹壁。

3.4 超聲引導(dǎo)下穿刺方法選擇

本研究表明，開(kāi)腹法及超聲法接種腫瘤與腫瘤原位種植成功率沒(méi)有差別。但開(kāi)腹接種方法兔損傷大，并發(fā)癥較多，而超聲引導(dǎo)下接種，方法簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷小，并發(fā)癥少。根據(jù)本研究結(jié)果顯示，超聲引導(dǎo)下穿刺組織塊及組織塊懸液接種制作兔肝VX2腫瘤，組織塊植入法生長(zhǎng)的腫瘤體積大于組織塊懸液法，組織塊深植入法未出現(xiàn)異位種植。所以，依據(jù)本研究結(jié)論，推薦超聲引導(dǎo)下穿刺組織塊深植入法種植腫瘤。

[1]Okada M,Kudo S,Miyazaki O, et al.Antitumoral efficacy and pharmacokinetic p roperties of p irarubicin upon hepatic intra2arterial injection in the rabbit VX2 tumourmodel[J].Br J Cancer,1995,71(3): 518-524.

[2]Paeng JC, Jeong JM, Yoon CJ, et al. Lip iodol solution of 188 Re2HDD as a new therapeutic agent for transhepatic arterial embolization in livercancer: p reclinical study in a rabbit liver cancermodel[J].J NuclMed, 2003,44(12):2033-2038.

[3]王曉東,任軍,楊仁杰,等.VX2活細(xì)胞數(shù)與兔肝癌模型成功率及成瘤時(shí)間的關(guān)系[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2005,13(5):589-591.

[4]吳文娟,崔慧先,李海濤,等.兔VX2肝癌模型的建立及超聲觀察[J].中華超聲影像學(xué)雜志.2005,14(2):147-150.

[5]Lin WY,Chen J,Lin Y.Implantation of VX2 carcinoma into t he liver of rabbit s:a comparison of three direct-injection met hods[J].Vet MedSci,2002,64(7):649-652.

[6]Yoon CJ,Chung JW,Park J H,et al.Transcat heter arterial chemoembolization wit h paclitaxel2lipiodol solution in rabbit VX2 liver tumor[J]. Radiology,2003,229(1):126-131.

[7]王曉玲,等.肝血管瘤成像診斷的對(duì)比分析[J].中國(guó)醫(yī)療設(shè)備,2010,25(12):132-134.

[8]范義,劉靜華,胡衛(wèi)東,等.兔VX2肝癌模型制作方法的改進(jìn)[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2008,2(9):1038-1044.