代 利 李繡花 趙新平 董小霞 倪淑華

(山西醫(yī)科大學(xué)公共學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，山西 太原 030001)

目前，臨床一線的調(diào)脂藥物以他汀類及貝特類為主，但因需長(zhǎng)期應(yīng)用，或者聯(lián)合用藥，其肝臟損害的副作用常常成為限制其臨床應(yīng)用的重要原因〔1〕。芝麻作為常用的油料作物，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值已經(jīng)得到公認(rèn)〔2，3〕。其主要活性成分芝麻素具有降低膽固醇、抗氧化、降血壓等作用〔4〕。汪五三等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，芝麻素對(duì)撲熱息痛、酒精、四氯化碳所致的肝損傷有一定的保護(hù)作用，對(duì)非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的作用如何研究報(bào)道較少。本研究探討芝麻素對(duì)大鼠NAFLD的防治作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 飼料配制、動(dòng)物分組及喂養(yǎng) 基礎(chǔ)飼料由山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，高脂飼料按1%膽固醇、5%豬油、0.25%膽酸鹽、93.75%基礎(chǔ)飼料的比例配。由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供清潔級(jí)SD雄性大鼠，體重90～110 g，經(jīng)基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，測(cè)體重及血清總膽固醇(TC)，按體重及血清TC水平將動(dòng)物隨機(jī)分為普通對(duì)照組、高脂模型組、芝麻素低、中、高劑量組，每組8只動(dòng)物。大鼠單籠喂養(yǎng)，自由攝食及飲水，每周測(cè)量1次體重及攝食量，觀察記錄動(dòng)物生長(zhǎng)與進(jìn)食情況。動(dòng)物室溫度控制在22℃，相對(duì)濕度65% ～70%，實(shí)驗(yàn)期9 w。實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料，其余各組喂飼高脂飼料，芝麻素低、中、高劑量組分別給予芝麻素混懸液20、40、80 mg·kg－1·d－1灌胃。

1.2 標(biāo)本采集與制備 實(shí)驗(yàn)9 w結(jié)束，處死大鼠取出肝臟并稱重，部分肝臟用生理鹽水漂洗數(shù)次后，濾紙拭干;稱取1 g剪碎，加冰生理鹽水至總體積為10 ml。用玻璃勻漿器在冰水中進(jìn)行碾磨勻漿，制成10%勻漿。4 000 r/min、4℃離心3 min，取上清，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。另取部分肝右葉，用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，作肝臟病理組織學(xué)檢查。

1.3 生化指標(biāo) 用酶比色法測(cè)定肝勻漿TC、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，試劑盒均由中生北控生物科技股份有限公司提供 。用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)丙二醛(MDA)、用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)，試劑盒均由南京建成生物研究所提供。以上指標(biāo)嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟測(cè)定。

1.4 分子生物學(xué)指標(biāo) RT-PCR方法檢測(cè)肝組織CYP2E1 mRNA表達(dá):①按Trizol試劑盒說明從大鼠肝臟中提取總RNA;②成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈;;③PCR擴(kuò)增:引物及內(nèi)參序列，見表1。CYP2E1擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3 min;94℃變性60 s，60℃退火60 s，72℃延伸60 s;30個(gè)循環(huán)，72℃ 8 min。取PCR產(chǎn)物約4μl，以1%瓊脂糖凝膠電泳30～40 min，紫外燈下觀察目的條帶。凝膠成像分析系統(tǒng)成像后測(cè)定目的條帶的積分光密度值，計(jì)算出目的基因與內(nèi)參兩者的積分光密度比，即為各基因表達(dá)的相對(duì)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，多組計(jì)量資料用單因素方差分析，用LST統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行多組間的兩兩比較。

表1 CYP2E1及內(nèi)參(GADPH)核酸序列

2 結(jié)果

2.1 芝麻素對(duì)大鼠的體重和肝指數(shù)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組動(dòng)物體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。高脂模型組與正常對(duì)照組相比肝指數(shù)升高(P＜0.05);芝麻素各劑量組與高脂模型組相比，肝指數(shù)均下降(P＜0.05);但芝麻素各劑量組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。

2.2 肝臟病理變化 大體形態(tài)觀察:正常組大鼠肝臟顏色鮮紅，質(zhì)地柔軟，富有彈性;模型組大鼠肝臟體積明顯增大，呈黃褐色，觸之有油膩感，邊緣飽滿，質(zhì)地稍韌;芝麻素各組大鼠肝臟體積較模型組略小，顏色呈較淺淡的黃褐色，質(zhì)地、彈性和柔韌性較模型組略好。病理切片觀察:正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰，中央靜脈大而壁薄，肝細(xì)胞排列成肝索，在中央靜脈周圍呈放射狀排列;模型組大鼠肝組織見重度脂肪變(即脂肪變性的肝細(xì)胞占肝小葉2/3以上)，肝細(xì)胞體積增大，排列紊亂，索狀結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞內(nèi)充滿以大空泡為主的混合性空泡，部分伴肝細(xì)胞水樣變，細(xì)胞核被擠向包膜;各實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞脂肪變性程度明顯減輕，表現(xiàn)為脂肪變性，肝細(xì)胞數(shù)目明顯減少，胞漿內(nèi)脂滴減少或消失，肝竇清晰可見，肝索排列整齊，無細(xì)胞壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，說明各干預(yù)因素均可以明顯減輕肝脂肪變性的程度。見圖1。

圖1 各組肝臟病理組織觀察(HE，×400)

2.3 芝麻素對(duì)大鼠肝脂的影響 高脂模型組較正常對(duì)照組TC、TG、LDL-C均升高(P＜0.05);芝麻素三個(gè)劑量組較高脂模型組TC、TG、LDL-C均下降(P＜0.05)。隨芝麻素劑量增加TC、TG、LDL-C含量逐漸下降(P＜0.05)。見表3。

2.4 芝麻素對(duì)大鼠SOD、MDA的影響 高脂模型組較正常對(duì)照組SOD活力有所下降(P＜0.01)，芝麻素各劑量組SOD活力較高脂模型組均升高(P＜0.01)，且隨芝麻素劑量增加SOD活力增加。高脂模型組較正常對(duì)照組MDA高(P＜0.01);芝麻素各劑量組MDA含量均低于高脂模型組(P＜0.01)，與正常對(duì)照組無差異，芝麻素各劑量組間也無差異。見表4。

表2 芝麻素對(duì)大鼠體重及肝指數(shù)的影響(x ± s，n=8)

表3 芝麻素對(duì)大鼠肝勻漿TC、TG和LDL的影響(mmol/L，x ± s，n=8)

2.5 芝麻素對(duì)CYP2E1 mRNA表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比(0.846±0.026)，高脂模型組CYP2E1 mRNA表達(dá)水平顯著增加(1.535±0.084，P＜0.05)，高、中、低劑量芝麻素各組CYP2E1 mRNA表達(dá)水平明顯低于高脂模型組(0.801±0.017，0.795±0.016，0.881±0.046，P ＜0.05)。見圖2。

表4 芝麻素對(duì)大鼠肝勻漿SOD、MDA的影響(x ± s，n=8)

圖2 RT-PCR檢測(cè)CYP2E1及GAPDH的表達(dá)

3 討論

脂肪肝的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，至今尚未完全闡明。Day等〔3〕提出的“二次打擊”學(xué)說在目前學(xué)術(shù)界得到較為普遍的認(rèn)可。該學(xué)說認(rèn)為初次打擊主要為高脂飲食，胰島素抵抗、瘦素抵抗等原因引起的肝臟脂肪代謝障礙。肝細(xì)胞脂肪變性是肝細(xì)胞對(duì)代謝障礙的適應(yīng)性改變，同時(shí)也使肝細(xì)胞活性下降，對(duì)損傷的敏感性增加，且肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積為氧應(yīng)激脂質(zhì)過氧化提供了足夠的反應(yīng)基質(zhì);二次打擊是以氧應(yīng)激脂質(zhì)過氧化為主，活性氧大量生成，脂質(zhì)過氧化伴細(xì)胞因子的活化，進(jìn)而引起脂肪變性的肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死、甚至纖維化。因此，兼有調(diào)脂和抗氧化雙重作用的物質(zhì)會(huì)更有利于脂肪肝的防治。

CYP450酶系在脂肪酸、TC的生物轉(zhuǎn)化中起重要作用。既往關(guān)于它們與脂肪肝關(guān)系的研究較少，且結(jié)論不盡一致。研究表明CYP2E1在酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制中主要參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)〔6，7〕，在 NAFLD 中也起重要作用〔8〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，高脂飲食能使大鼠CYP2E1的活性顯著升高，并能在轉(zhuǎn)錄前水平誘導(dǎo)CYP2E1 mRNA水平和蛋白表達(dá)增強(qiáng)〔9〕。但Wagner等發(fā)現(xiàn)CYP2E1的表達(dá)在高脂情況下并沒有明顯增強(qiáng)〔10〕。

本試驗(yàn)成功建立了NAFLD模型，并在高脂膳食的同時(shí)應(yīng)用芝麻素進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，芝麻素能降低肝組織中的脂質(zhì)水平及肝指數(shù)，減少脂肪酸的生成，緩解脂代謝紊亂，改善脂肪肝損傷;同時(shí)，本研究中各實(shí)驗(yàn)組肝組織MDA低于模型對(duì)照組、SOD活力高于模型對(duì)照組，說明芝麻素通過減少脂質(zhì)過氧化及發(fā)揮抗氧化作用抑制了脂質(zhì)過氧化損傷，從而使肝臟免受損害。本研究高脂模型組大鼠肝組織CYP2E1 mRNA表達(dá)顯著升高，說明CYP2E1 mRNA的增加使肝自由基產(chǎn)生增多，促進(jìn)脂肪肝病變的進(jìn)展。芝麻素能降低肝組織CYP2E1 mRNA的表達(dá)，提示芝麻素能有效減輕氧應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，增強(qiáng)肝內(nèi)脂肪酸氧化，保護(hù)肝細(xì)胞。

綜上所述，芝麻素能降低脂肪肝大鼠肝中脂質(zhì)的含量，阻礙了初次打擊對(duì)脂肪肝形成的作用;同時(shí)能顯著增加SOD活性，抑制氧化代謝產(chǎn)物MDA含量，顯著降低CYP2E1 mRNA的表達(dá)，因而能從提高機(jī)體抗氧化的能力，阻斷第二次打擊對(duì)肝細(xì)胞脂肪病變的進(jìn)展。因而對(duì)NAFLD有一定的預(yù)防作用。

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