史春艷 姚春麗

(長春市中心醫(yī)院，吉林 長春 130062)

日光中的紫外線(utltraviolet，UV)輻射直接導致皮膚光老化。紫外線分為三個波段:UVA 320～400 nm，UVB 280～320 nm，UVC 200～280 nm〔1〕。UVC 一般被地面大氣層中的氧及臭氧所吸收，主要導致皮膚損傷的是UVA和UVB。UVA對皮膚的穿透能力高于UVB，可深達皮膚基底層和真皮層，UVB作用于皮膚表皮層，是引起皮膚紅斑和色素沉著及皮膚粗糙、多皺的主要因素〔2，3〕。

1 材料與方法

1.1 動物 健康Wistar大鼠30只，清潔級，體重(250±20)g，由吉林大學實驗動物中心提供，隨機分為對照組、模型組及MSCs治療組，每組10只。

1.2 試劑與儀器 胎牛血清、L-DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)，胰蛋白酶(SIGMA公司)，RNA提取試劑盒(北京博邁德公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus)，凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀(美國伯樂公司)。

1.3 骨髓間充質干細胞(MSCs)的分離、培養(yǎng) 無菌分離Wistar大鼠股骨，注射器吸取 L-DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓，200μm濾網(wǎng)過濾成單細胞，以1×105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，傳至第3代備用。

1.4 模型制備 電動剃須刀剔除大鼠背部5 cm×6 cm區(qū)域的毛發(fā)，采用15 W UVA和UVB紫外燈，置于大鼠背部裸露皮膚區(qū)的正上方35 cm處，每日照射2 h并觀察大鼠皮膚變化，共照射60 d，對照組大鼠不做任何干預。

1.5 Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達 調細胞濃度為1×106/ml，在大鼠背部裸露皮膚區(qū)多點注射，1次/w，共8 w。頸椎脫臼處死各組動物，用銳利刀片取其背部照射區(qū)面積0.5 cm2大小的皮膚組織，采用RNA提取試劑盒提取RNA，根據(jù)GenBank的Ⅰ型、Ⅲ型膠原基因序列，以β-actin為內參照，設計、合成引物(見表1)，進行 RT-PCR 反應，50℃15 min，94℃2 min，94℃30 s，58℃、30 s，72℃1.5 min 30個循環(huán)。取PCR反應液5μl進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR擴增產(chǎn)物。

1.6 統(tǒng)計學分析 組間比較采用t檢驗。

2 結果

治療組Ⅰ型膠原表達明顯低于模型組，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。治療組Ⅰ型膠原表達接近于對照組(P＞0.05)。治療組Ⅲ型膠原表達高于模型組(P＜0.05)，但接近于對照組(P＞0.05)。表現(xiàn)出皮膚光老化早期改變的特征。即模型組Ⅰ型膠原顯著增高，Ⅲ型膠原減少。見圖1。

表1 RT-PCR檢測中引物序列

圖1 RT-PCR檢測Ⅰ型、Ⅲ型膠原在各組的表達

3 討論

成人皮膚中主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原，其中Ⅰ型膠原約占皮膚膠原干重的85%，是維持皮膚張力和承受拉力的重要成分，也是維持皮膚飽滿充盈的物質基礎。Ⅲ型膠原是幼稚、纖細的膠原纖維，是構成網(wǎng)狀纖維的主要成分，在胚胎期占皮膚干重的50%。日光照射可影響I型膠原的形成，Ⅲ型膠原相對增加，最終導致成熟膠原束減少，皮膚出現(xiàn)松弛和皺紋。UV可使膠原發(fā)生改變，導致皮膚損傷〔4〕。UV照射可使真皮成纖維細胞功能受損，合成和分泌前膠原蛋白的能力下降，使MMP高表達，能特異性的降解幾乎所有的細胞外基質成分，破壞膠原纖維和彈力纖維的正常結構。MMP在真皮中的堆積會加重真皮的氧化性損傷，進一步抑制成纖維細胞的增殖及膠原的合成〔5，6〕。

MSCs具有自我更新和多向分化潛能，MSCs可誘導轉化為表皮樣細胞;也觀察到MSCs在體內外實驗中參與真皮組織重建〔7，8〕。MSCs移植在損傷組織的重建及修復慢性損傷中均起著重要作用。MSCs多點注射治療皮膚光老化發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型膠原纖維相對含量減少，治療組Ⅰ型膠原表達明顯低于模型組;Ⅲ型膠原纖維的相對含量提高，治療組Ⅲ型膠原表達高于模型組。提示MSCs移植后對皮膚光老化有治療作用，其具體機制有待于進一步研究探討。

1 Hajnoczky G，Csordas G，Madesh M，et al.Control of apoptosis by IP3 and ryanodine receptor driven calcium signals〔J〕.Cell Caleium，2000;28:349-63.

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3 史春夢，程天民.大鼠真皮多能間充質干細胞的分離培養(yǎng)〔J〕.第三軍醫(yī)大學學報，2001;23(9):1068-70.

4 朱彥君，孟宇宏，馮光珍，等.紫外線照射后無毛鼠皮膚膠原的變化及其定量分析〔J〕.中華醫(yī)學美學美容雜志，2005;11(3):159-62.

6 Wondrak GT，Roberts MJ，Cervantes-Laurean D，et al.Proteins of the extracellular matrix are sensitizers of Photo-oxidative stress in human skin Cells〔J〕.Invest Dermatology，2003;121(3):578-86.

7 Varani J，Spearman D，Perone P，et al.Inhibition of typeⅠprocollagen synthesis by damaged collagen in photoaged skin and by collagenase-degraded collagen in Vitro〔J〕.Am J Pathol，2001;158(3):931-42.

8 鐘曉紅，王明剛，趙李平，等.骨髓間充質干細胞在糖尿病模型創(chuàng)面中向表皮細胞分化的初步研究〔J〕.中國美容醫(yī)學，2010;19(1):65-7.