史春艷 姚春麗
(長春市中心醫(yī)院,吉林 長春 130062)
日光中的紫外線(utltraviolet,UV)輻射直接導致皮膚光老化。紫外線分為三個波段:UVA 320~400 nm,UVB 280~320 nm,UVC 200~280 nm〔1〕。UVC 一般被地面大氣層中的氧及臭氧所吸收,主要導致皮膚損傷的是UVA和UVB。UVA對皮膚的穿透能力高于UVB,可深達皮膚基底層和真皮層,UVB作用于皮膚表皮層,是引起皮膚紅斑和色素沉著及皮膚粗糙、多皺的主要因素〔2,3〕。
1.1 動物 健康Wistar大鼠30只,清潔級,體重(250±20)g,由吉林大學實驗動物中心提供,隨機分為對照組、模型組及MSCs治療組,每組10只。
1.2 試劑與儀器 胎牛血清、L-DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司),胰蛋白酶(SIGMA公司),RNA提取試劑盒(北京博邁德公司),倒置顯微鏡(日本Olympus),凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀(美國伯樂公司)。
1.3 骨髓間充質干細胞(MSCs)的分離、培養(yǎng) 無菌分離Wistar大鼠股骨,注射器吸取 L-DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓,200μm濾網(wǎng)過濾成單細胞,以1×105/ml接種于培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng),傳至第3代備用。
1.4 模型制備 電動剃須刀剔除大鼠背部5 cm×6 cm區(qū)域的毛發(fā),采用15 W UVA和UVB紫外燈,置于大鼠背部裸露皮膚區(qū)的正上方35 cm處,每日照射2 h并觀察大鼠皮膚變化,共照射60 d,對照組大鼠不做任何干預。
1.5 Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達 調細胞濃度為1×106/ml,在大鼠背部裸露皮膚區(qū)多點注射,1次/w,共8 w。頸椎脫臼處死各組動物,用銳利刀片取其背部照射區(qū)面積0.5 cm2大小的皮膚組織,采用RNA提取試劑盒提取RNA,根據(jù)GenBank的Ⅰ型、Ⅲ型膠原基因序列,以β-actin為內參照,設計、合成引物(見表1),進行 RT-PCR 反應,50℃15 min,94℃2 min,94℃30 s,58℃、30 s,72℃1.5 min 30個循環(huán)。取PCR反應液5μl進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳,觀察PCR擴增產(chǎn)物。
1.6 統(tǒng)計學分析 組間比較采用t檢驗。
治療組Ⅰ型膠原表達明顯低于模型組,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療組Ⅰ型膠原表達接近于對照組(P>0.05)。治療組Ⅲ型膠原表達高于模型組(P<0.05),但接近于對照組(P>0.05)。表現(xiàn)出皮膚光老化早期改變的特征。即模型組Ⅰ型膠原顯著增高,Ⅲ型膠原減少。見圖1。
表1 RT-PCR檢測中引物序列
圖1 RT-PCR檢測Ⅰ型、Ⅲ型膠原在各組的表達
成人皮膚中主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原,其中Ⅰ型膠原約占皮膚膠原干重的85%,是維持皮膚張力和承受拉力的重要成分,也是維持皮膚飽滿充盈的物質基礎。Ⅲ型膠原是幼稚、纖細的膠原纖維,是構成網(wǎng)狀纖維的主要成分,在胚胎期占皮膚干重的50%。日光照射可影響I型膠原的形成,Ⅲ型膠原相對增加,最終導致成熟膠原束減少,皮膚出現(xiàn)松弛和皺紋。UV可使膠原發(fā)生改變,導致皮膚損傷〔4〕。UV照射可使真皮成纖維細胞功能受損,合成和分泌前膠原蛋白的能力下降,使MMP高表達,能特異性的降解幾乎所有的細胞外基質成分,破壞膠原纖維和彈力纖維的正常結構。MMP在真皮中的堆積會加重真皮的氧化性損傷,進一步抑制成纖維細胞的增殖及膠原的合成〔5,6〕。
MSCs具有自我更新和多向分化潛能,MSCs可誘導轉化為表皮樣細胞;也觀察到MSCs在體內外實驗中參與真皮組織重建〔7,8〕。MSCs移植在損傷組織的重建及修復慢性損傷中均起著重要作用。MSCs多點注射治療皮膚光老化發(fā)現(xiàn),Ⅰ型膠原纖維相對含量減少,治療組Ⅰ型膠原表達明顯低于模型組;Ⅲ型膠原纖維的相對含量提高,治療組Ⅲ型膠原表達高于模型組。提示MSCs移植后對皮膚光老化有治療作用,其具體機制有待于進一步研究探討。
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