薛昊罡 冷 冰 馬恩元 蔣維海 崔 雙 單廣宇 苗婷婷

(北華大學第一臨床醫(yī)院骨外科，吉林 吉林 132011)

糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)生可能與晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)引起骨代謝紊亂有關。由于慢性高血糖導致AGEs積聚，使骨蛋白及骨細胞分化受到影響，骨代謝平衡失調(diào)，引發(fā)骨質(zhì)疏松。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)已被證明是成骨細胞轉(zhuǎn)化促進因子，具有較強的促進骨形成的作用〔1〕。目前，BMP-2的研究多集中于骨誘導及骨愈合方面，有關BMP-2在骨質(zhì)疏松發(fā)病機制中的作用尚未見報道。本研究旨在進一步研究AGEs在分子水平對骨代謝影響的作用機制，為臨床預防及治療糖尿病骨質(zhì)疏松提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究材料 健康6個月齡Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，雌雄各半，體重170～220g，購自北華大學動物實驗室。所有大鼠均喂養(yǎng)于塑料鼠盒內(nèi)，專人飼養(yǎng)，每籠4只。飼養(yǎng)于北華大學實驗動物中心清潔級環(huán)境，室內(nèi)通風良好，室溫(22±2)℃，相對濕度70% ～75%，晝夜周期12h環(huán)境中適應性飼養(yǎng)2w，所有大鼠不限制飲食，自由攝入標準固體顆粒飼料(含1.13%鈣、0.66%磷，北華大學動物實驗室提供)和自來水。適應性喂養(yǎng)1w后進行分組飼養(yǎng)。實驗過程中對動物處置符合科學技術部2006年《關于善待實驗動物的指導性意見》的要求。

1.2 研究方法

1.2.1 分組 采用隨機數(shù)字表法將24只大鼠隨機分為對照組和糖尿病骨質(zhì)疏松組，每組12只，兩組大鼠的體重、月齡及喂養(yǎng)條件均無明顯差異，具有一致性(P＞0.05)。其中對照組大鼠均喂以普通飼料，糖尿病骨質(zhì)疏松組喂以高糖高脂飼料(普通飼料中添加10%豬油、10%蛋黃粉和20%蔗糖)喂養(yǎng)8w(不限每日熱量)，禁食12h后一次性左下腹腔注射 STZ(65mg/kg體重)，正常對照組腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。2w后，每周固定時間大鼠尾靜脈采血測血糖，做腹腔內(nèi)葡萄糖耐量(Intraperitonealglucosetolerancetest，IPGTT)。方法為:大鼠禁食6～8h，按2g/kg體重腹腔注射30%葡萄糖溶液，尾靜脈采血測定 0、30、60、120min血糖，以空腹血糖(FPG)≥7.0mmol/L，或糖負荷后2h血糖≥11.1mmol/L者為糖尿病造模成功鼠〔2〕。成模后所有大鼠每周固定時間測血糖和體重，持續(xù)觀察20w。剔除死亡和造模未成功大鼠，糖尿病骨質(zhì)疏松組最后納入統(tǒng)計的大鼠為10只。

1.2.2 檢測指標及方法

1.2.2.1 標本取材與保存 各組動物在完成整個實驗過程后、處死取材前進入代謝籠，收集24h尿液，經(jīng)腹腔靜脈抽血處死，取實驗動物第2腰椎椎體〔3〕。尿和血標本及時檢驗或放入低溫冰箱保存，骨標本分別在低溫冰箱、液氮或甲醛固定保存。1.2.2.2 血清學指標測定 血清Ca、P、FPG、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)的測定由全自動生化分析儀使用比色法測定，抗凝血糖化血紅蛋白(HbA1c)的測定采用比色法，血清胰島素(INS)、白介素(IL)-6、胰島素樣生長因子(IGF)-I、BGP的測定采用放射免疫法，用Hitachi-850型熒光分光光度計測定血清中AGEs的含量〔4〕。公式計算如下:IAI=In(1/FINS×FPG)，IR=FPG ×FINS/22.5。

1.2.2.3 骨形態(tài)學計量測定 采用美國GDR-2000型Hologac雙光能X射線骨密度儀測量大鼠腰椎、股骨及脛骨及總骨密度。應用CMIAS型北航多功能病理彩色圖像分析系統(tǒng)計算平均骨小梁寬度、平均骨皮質(zhì)厚度、骨小梁百分比、平均骨小梁間距〔5〕。

1.2.2.4 骨組織中BMP-2的免疫組織化學染色 用實驗大鼠椎體松質(zhì)骨作為實驗材料，取第2腰椎的錐體，4%多聚甲醛固定，15%EDTA溶液脫鈣，梯度酒精逐級脫水后，石蠟包埋、切片，用1∶200兔抗大鼠BMP-2多克隆抗體作為第一抗體，1∶200生物素化山羊抗兔IgG作為第二抗體，DAB顯色，顯微鏡下觀察有棕黃色物質(zhì)出現(xiàn)時停止，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片〔6〕。

1.2.2.5 骨組織中BMP-2的原位雜交 用實驗大鼠椎體松質(zhì)骨作為實驗材料，處死大鼠后，剝離出腰椎椎體，置于4%多聚甲醛固定，經(jīng)20%EDTA脫鈣，乙醇上行梯度脫水，石蠟包埋，骨縱行切片(6μm厚)后按BMP-2原位雜交試劑盒進行操作，具體操作步驟如下:①使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。②根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔。③加入稀釋好后的標準品50μl于反應孔，加入待測樣品50μl于反應孔內(nèi)。立即加入50μl生物素標記的抗體〔7〕。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1h。④甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加1次。⑤每孔加入80μl的親和鏈霉素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30min。⑥甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加1次。⑦每孔加入底物A、B各50μl，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10min。避免光照。⑧取出酶標板，迅速加入50μl終止液，加入終止液后應立即測定結(jié)果。⑨在450nm波長處測定各孔的OD值。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示，結(jié)果用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠體重變化 糖尿病組大鼠與正常對照組大鼠相比，在食用高脂飲食后體重迅速增長，并在高脂飲食8w后明顯高于對照組(P＜0.05);而在注射STZ后糖尿病組大鼠的體重增長明顯緩慢，至20w實驗結(jié)束時體重明顯低于正常對照組(P＜0.05)。見表1。

2.2 兩組大鼠血糖變化 單純給予高脂飲食對兩組大鼠的血糖無明顯影響，但注射STZ后糖尿病組的血糖明顯升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

2.3 兩組大鼠代謝相關生化指標和細胞因子的變化 糖尿病組大鼠的血清鈣、磷水平與對照組相比均無明顯差異(P＞0.05);血清 TG、TC、BGP、IGF-1、IL-6 等與對照組相比有明顯差異(P＜0.05)。見表3。

表1 注射STZ前后兩組大鼠體重變化情況(x ± s，g)

表2 注射STZ前后兩組大鼠血糖變化情況(x ± s，mmol/L)

表3 兩組大鼠代謝相關生化指標和細胞因子的變化情況(x±s)

表4 兩組大鼠血清AGEs、HbAlc、INS及IR的變化情況比較(x±s)

2.4 兩組大鼠血清AGEs、HbAlc、INS及IR的變化 糖尿病組大鼠血清AGEs、HbAlc、INS及IR等指標與正常對照組相比有明顯差異(P＜0.05)。見表4。

2.5 兩組大鼠骨組織形態(tài)計量學參數(shù)的變化 糖尿病組大鼠的骨小梁相對體積、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量及骨小梁分離度等骨組織形態(tài)計量學參數(shù)靜態(tài)指標與對照組相比均有明顯差異(P＜0.05)。見表5。另外，由表6可知糖尿病組大鼠的骨礦化沉積率、骨形成率及單位骨小梁面積上破骨細胞數(shù)等骨組織形態(tài)計量學參數(shù)動態(tài)指標與對照組相比均有明顯差異(P＜0.05)。兩組大鼠的股骨和脛骨X線片見圖1。

表5 兩組大鼠骨組織形態(tài)計量學參數(shù)靜態(tài)指標的變化(x±s)

表6 兩組大鼠骨組織形態(tài)計量學參數(shù)動態(tài)指標的變化(x±s)

圖1 對照組及糖尿病組大鼠股骨和脛骨的X線攝片

2.6 BMP-2蛋白表達及平均光密度值 BMP-2蛋白主要沉積于骨細胞。對照組大鼠骨組織BMP-2蛋白表達強烈且廣泛，染色深，有的甚至成片狀;糖尿病組亦出現(xiàn)BMP-2蛋白的陽性表達，但均散在且淡染。見圖2。糖尿病組的BMP-2蛋白表達染色平均光密度(1.29±0.29)較對照組(3.41±0.43)明顯升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖2 BMP-2蛋白表達免疫組化染色

2.7 BMP-2mRNA表達及平均光密度值 糖尿病組原位雜交陽性染色出現(xiàn)于部分成骨細胞、骨細胞，陽性著色較深;對照組原位雜交陽性染色較廣泛出現(xiàn)于成骨細胞、骨細胞及部分間充質(zhì)細胞，陽性著色深。見圖3。糖尿病組大鼠椎骨、脛骨上段BMP-2mRNA表達染色平均光密度(0.12±0.019)較對照組(0.21±0.031)明顯降低(P＜0.05)。

圖3 骨組織BMP-2mRNA表達情況

2.8 大鼠血清AGEs與BMP-2mRNA和蛋白表達的關系血清AGEs與BMP-2mRNA和蛋白表達呈顯著負相關，相關系數(shù)分別為 －0.715(P＜0.05)、－0.621(P＜0.05)。

3 討論

AGEs是體內(nèi)糖的醛基或酮基與蛋白質(zhì)等的自由氨基經(jīng)過非酶促糖基化反應形成的一類復合物，這些復合物呈異質(zhì)性，棕褐色，具有熒光性和高度交聯(lián)性，正常情況下AGEs是機體組織重建和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所需的，過多積累則引起許多病理改變。本文研究結(jié)果顯示糖尿病組大鼠的AGEs水平較對照組明顯升高。這主要是由于AGEs抑制間充質(zhì)干細胞(MSCs)增殖，誘導凋亡，并阻止其分化為脂肪組織、軟骨和骨組織，提示AGEs在老年糖尿病病人肌肉骨骼紊亂發(fā)病過程的毒害效應;AGEs介導的交聯(lián)大分子蛋白質(zhì)可溶性降低，對蛋白溶解酶的抵抗性增高，導致組織(如彈性膠原)理化和機械特性的改變。這與本文兩組大鼠骨組織形態(tài)計量學參數(shù)比較結(jié)果是一致的。Hein等〔8〕取自于骨質(zhì)疏松患者的骨樣本中，通過免疫組化發(fā)現(xiàn)存在骨蛋白的AGEs免疫反應強烈區(qū)域，其與骨重建參數(shù)具有相關性。這一研究表明，骨蛋白及骨細胞分化也受AGEs積聚的影響。Yamamoto〔9〕研究表明，在糖尿病骨質(zhì)疏松患者當中AGEs通過與細胞表面受體作用而導致骨形成減少，骨吸收增加。Lu〔10〕在STZ誘導的糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)IGF-1和成纖維細胞生長因子表達下降，調(diào)節(jié)成骨細胞分化的基因(Cbfa1/Runx-2和Dlx5)表達不足，導致骨形成降低。Santana〔11〕在糖尿病動物的顱蓋骨組織間充質(zhì)細胞、成骨細胞中，證實RAGE的表達上調(diào)。國內(nèi)張磊〔12〕等的研究證實了糖尿病大鼠血清AGEs明顯升高，骨密度則明顯降低。李濤等〔13〕的研究證實糖尿病大鼠存在著骨質(zhì)疏松現(xiàn)象，且AGEs明顯高表達。王秀玲〔14〕等證實患者AGEs結(jié)合細胞表面的RAGE產(chǎn)生過多的TNF-α、IL-1、IL-6等細胞因子，血清TNF-α、IL-6、EGF水平和BMD呈顯著負相關。國內(nèi)外的研究均提示了AGEs與糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松發(fā)病的相關性。

在骨的形成過程中，成骨細胞的產(chǎn)生、增殖、分化受多種因素的調(diào)節(jié)，其中BMP-2在成骨細胞分化過程中起非常關鍵的作用〔15〕。BMP-2通過促進成骨細胞分化和促進其他成骨因子的表達而促進骨形成。BMP作為轉(zhuǎn)化生長因子(TGFβ)超家族，其中，BMP-2是骨誘導活性最強的一種〔16〕。離體的BMP-2可誘導成骨細胞前體細胞幼稚軟骨細胞或成熟軟骨細胞分化為較成熟的成骨細胞樣細胞〔17〕。有報道IGF-1促進成骨細胞的增殖、分化以及促進長骨的生長可能是通過增加細胞中BMP-2基因表達所介導的〔18〕。有關AGEs與糖尿病骨質(zhì)疏松BMP-2基因表達相關性的研究等報道較少。目前有關AGEs與糖尿病骨組織中BMP-2基因相關性的研究罕見報道。本文研究結(jié)果顯示糖尿病組BMP-2在mRNA和蛋白表達水平均較正常對照組明顯降低，這表明糖尿病骨質(zhì)疏松可能與BMP-2的表達水平有關。

綜上所述，AGEs和BMP-2均參與了糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展;而有效的血糖控制可減少AGEs生成，增加BMP-2的表達，從而延緩糖尿病性骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展。

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