陳 姬，陳 娜，陳小宇，張 波，田 卉，鄭秋生

(石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，新疆石河子 832002)

惡性腫瘤在生長過程中會侵潤周圍組織或轉(zhuǎn)移到身體的其他部位，這種侵潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的一個重要特征，也是腫瘤病人致死和治療失敗的主要原因［1］。小鼠黑色素瘤B16F1細胞因其來源及基因背景清楚，已廣泛地用于研究腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程及影響腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移的相關(guān)參數(shù)［2］。

紫杉醇(paclitaxel，F(xiàn)ig 2)是目前全世界公認治療腫瘤的有效藥物。維泰醇(alternol，F(xiàn)ig 1)是廣東汕頭雙駿生物有限公司利用紅豆杉樹皮中的一種微生物菌誘變株，經(jīng)發(fā)酵純化等工藝生產(chǎn)出的一種新型化合物。由于維泰醇與紫杉醇具有相同的來源，因此我們推測維泰醇有可能同樣具有抗腫瘤的活性。本實驗比較維泰醇與紫杉醇的抗腫瘤轉(zhuǎn)移及抗血管新生作用。探討維泰醇是否也同紫杉醇一樣具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移及抗血管新生的能力。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑維泰醇由廣東汕頭雙駿生物有限公司提供，紫杉醇購于Sigma公司。RPMI 1640細胞培養(yǎng)基購于Gibco BRL公司，新生牛血清，胎牛血清購于北京四季青生物工程有限公司。Matrigel購于美國BD公司。MMP-2 ELSAE試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

Fig 1 Chemical structure of alternol

Fig 2 Chemical structure of paclitaxel

1.2SRB法測定藥物對B16F1細胞的抑制率取B16F1細胞，加入不同濃度的維泰醇和紫杉醇，終濃度為 5、10、20、40、80、160 nmol·L－1，每個濃度設(shè) 6個平行空，酶標(biāo)儀在波長490 nm處檢測各孔OD值。

1.3臺盼藍染色法測定致死率用血球計數(shù)板計數(shù)細胞，計算細胞死亡率。

1.4B16F1劃痕試驗按照 Fishman等［3］的試驗方法，取細胞于48孔板，細胞至0.9融合度時，以200 μl Tip頭均勻劃痕，用含0.001的小牛血清的培養(yǎng)液輕輕洗去脫落細胞，各組分別加入不同濃度維泰醇和紫杉醇的無血清培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱孵育48 h至空白組劃痕基本愈合。拍照并分析，采用Photoshop 6.0軟件計算劃痕愈合率。

1.5明膠酶譜實驗明膠酶活性測定按照Lalu等［4］的方法。收集細胞上清，明膠酶電泳，結(jié)束后，復(fù)性，孵育。最后以考馬斯亮藍染色液染色30 min，脫色液脫色至膠條呈藍色均一背景，亮白色條帶。拍照，并進行分析。

1.6MMP-2表達的測定MMP-2表達的測定使用MMP-2(總)ELISA試劑盒。按照試劑盒操作，酶標(biāo)儀在450 nm測定OD值。

1.7SRB法測定血管內(nèi)皮細胞活力取ECV304細胞，加入不同濃度維泰醇與紫杉醇，每個濃度設(shè)6個平行空，酶標(biāo)儀在波長490 nm處檢測個孔OD值。

1.8吖啶橙/溴化乙錠熒光染色法觀察細胞形態(tài)取ECV304細胞，加入不同濃度維泰醇與紫杉醇，培養(yǎng)48 h，染色，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.9血管內(nèi)皮細胞劃痕試驗取ECV304細胞，劃痕后加入不同濃度維泰醇與紫杉醇的無血清培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱孵育48h至空白組劃痕基本愈合。拍照并分析，用Photoshop 6.0軟件計算劃痕愈合率。1.10管腔樣結(jié)構(gòu)實驗參照Mezentsev等［5］的方法，將Matrigel膠4℃過夜溶解，加入到24孔培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)箱促凝30 min，用含0.005胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整ECV304細胞濃度，接種于Matrigel膠上，37℃ 孵育1 h后，洗滌除去未貼壁的細胞，每空分別加入含不同濃度維泰醇與紫杉醇的培養(yǎng)基共同孵育20 h。顯微鏡觀察并拍照。

1.11數(shù)據(jù)分析所有試驗設(shè)3個平行組或重復(fù)3次，結(jié)果以±s表示，以t檢驗進行組間統(tǒng)計學(xué)差異比較。

2 結(jié)果

2.1B16F1細胞抑制率比較本試驗濃度范圍內(nèi)，維泰醇和紫杉醇對B16F1細胞的增殖均有一定抑制作用，但維泰醇的增殖抑制作用較弱(Fig 3)。在顯微鏡下觀察，80 nmol·L－1的維泰醇和紫杉醇處理后的細胞貼壁仍比較牢固，培養(yǎng)液中未見大量脫落細胞，選擇此濃度，在低毒條件下進行維泰醇與紫杉醇的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的比較。

Fig 3 Effects of alternol and paclitaxel on B16F1 cell proliferation and survival

2.2B16F1劃痕實驗比較劃痕后培養(yǎng)基中不含血清，細胞基本不會增殖，劃痕愈合完全靠細胞的遷移運動，愈合面積代表腫瘤細胞的遷移運動能力［6］。與空白組相比，80 nmol·L－1維泰醇和紫杉醇均能降低B16F1細胞的運動能力(Fig 4)，同濃度時，維泰醇抑制細胞遷移的能力略弱于紫杉醇。

2.3明膠酶譜實驗MMP-2降解蛋白出現(xiàn)負染條帶的面積和亮度表現(xiàn)細胞分泌MMP-2活力的強弱。與空白相比(Fig 5)，80 nmol·L－1的維泰醇和紫杉醇處理后的條帶的面積和亮度都有所降低，紫杉醇的條帶明顯弱于維泰醇，說明維泰醇抑制B16F1細胞分泌MMP-2的能力弱于紫杉醇。

2.4MMP-2表達影響的比較結(jié)果顯示(Fig 6)，與對照比較，80 nmol·L－1的維泰醇和紫杉醇均能降低B16F1細胞的MMP-2表達，且維泰醇的作用略弱于紫杉醇。

2.5血管內(nèi)皮細胞增殖抑制的比較維泰醇和紫杉醇均能抑制血管內(nèi)皮細胞ECV304的增殖(Fig 7)。維泰醇和紫杉醇藥物濃度均為80 nmol·L－1時，對ECV304細胞的生長抑制率分別為0.33和0.57。

Fig 4 Alternol and paclitaxel inhibited the migration of B16F1 cell in vitro

Fig 5 Effects of alternol and paclitaxel on MMP-2 activity of B16F1 cells detected by gelatin zymography assay

Fig 6 Effects of alternol and paclitaxel on MMP-2 expression of B16F1 cells

Fig 7 Effects of alternol and paclitaxel on ECV304 cell proliferation Data are presented as±s from six independent experiments.

2.6誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡作用的比較80 nmol·L－1的維泰醇和紫杉醇作用于ECV304細胞48 h后即能夠引起明顯的細胞凋亡現(xiàn)象(Fig 8)，維泰醇組為早期凋亡，紫杉醇組為晚期凋亡。

Fig 8 Effects of alternol and paclitaxel on ECV304 cell survival

2.7血管內(nèi)皮細胞劃痕實驗的比較劃痕48 h后，空白組細胞基本愈合(Fig 9)，維泰醇與紫杉醇處理后的細胞傷痕的愈合程度均降低于空白組，二者均能抑制 ECV304細胞的遷移，濃度為 80 nmol·L－1，維泰醇抑制ECV304細胞遷移的能力弱于紫杉醇。

2.8內(nèi)皮細胞管腔形成實驗的比較腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移都需要新血管的生成［7－9］。抑制血管生成從而抑制腫瘤在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移是一個重要的研究熱點［10］。本實驗(Fig 10)中，空白組細胞在matrigel膠重建的基底膜上形成完整的血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);80 nmol·L－1的維泰醇處理后，血管內(nèi)皮細胞拉伸程度降低，彼此間連接縫隙變大，部分血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的完整性發(fā)生破壞;80 nmol·L－1的紫杉醇處理后，血管內(nèi)皮細胞連接處已經(jīng)逐漸變圓，血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)已經(jīng)完全被破壞。說明二者均能有效抑制血管內(nèi)皮細胞管腔樣結(jié)構(gòu)的形成，從而對腫瘤內(nèi)部血管新生產(chǎn)生抑制作用。

3 討論

癌癥治療的目的在于徹底治愈腫瘤或延長患者生存期或改善患者生活質(zhì)量。當(dāng)前主要治療手段為手術(shù)切除、放療或化療，盡管手術(shù)切除作為早期惡性腫瘤最佳治療選擇，許多腫瘤根治切除后仍會發(fā)生轉(zhuǎn)移，一方面局限于目前的診斷手段，不能發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移灶，另一方面在于手術(shù)切除原發(fā)灶促進了腫瘤轉(zhuǎn)移及已有轉(zhuǎn)移灶的生長，大多惡性腫瘤患者最終不是死于腫瘤而是死于腫瘤的轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移引發(fā)的并發(fā)癥。因此，開發(fā)一類具有預(yù)防惡性腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移作用，無嚴重不良反應(yīng)，適于患者長期應(yīng)用的惡性腫瘤術(shù)后的輔助治療藥物勢在必行。

Fig 9 Alternol and paclitaxel inhibited the migration of ECV304 cells in vitro

Fig 10 Tube formation of ECV304 cells inhibited in vitro by alternol and paclitaxel

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤細胞和宿主細胞之間相互作用的連續(xù)過程，在這個過程中腫瘤細胞必須破壞細胞間質(zhì)和基底膜組成的細胞外基質(zhì)(ECM)屏障，這是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵一步［11］，在這個過程中細胞會分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，MMPs的表達能促進細胞株的侵襲能力［12］。研究發(fā)現(xiàn)［13］，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力與其產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生金屬蛋白酶的能力呈正相關(guān)。腫瘤的轉(zhuǎn)移，不單單是腫瘤細胞自身特性發(fā)生變化，還依賴于腫瘤細胞與間質(zhì)細胞以及細胞微環(huán)境之間的相互作用。越來越多的研究表明［14－15］，血管形成是腫瘤轉(zhuǎn)化，生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，腫瘤持續(xù)生長和轉(zhuǎn)移依賴新生血管，因此抑制血管新生無論對原發(fā)腫瘤，還是腫瘤擴散轉(zhuǎn)移都具有重要意義［16］。

本試驗結(jié)果表明，與紫杉醇相比較，維泰醇具有較低的細胞毒活性，同時具有較好抑制腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞的遷移能力。這提示維泰醇具有潛在的抗腫瘤活性，具體的機制需要進一步研究發(fā)現(xiàn)。維泰醇致死率和SRB數(shù)據(jù)說明其毒性相對較低，通過MMP-2和劃痕實驗發(fā)現(xiàn)其可能的作用機制在于抑制了腫瘤細胞某些遷移分子的表達，另一方面，其對血管內(nèi)皮細胞管腔形成有抑制，說明該化合物從兩個方面來抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。雖然維泰醇抗轉(zhuǎn)移能力略弱于紫杉醇，但其低細胞毒特性依然有望成為新的抗腫瘤轉(zhuǎn)移化合物。

［1］Sporn M B.The war on cancer［J］.Lancet，1996，347:1377 － 81.

［2］Zhao J，Qi Q，Yang Y，et al.Inhibition of alpha(4)integrin mediated adhesion was involved in t he reduction of B16F10 melanoma cells lung colonization in C57BL/6 mice treated with Gambogic acid［J］.Eur J Pharmacol，2008，589(1 －3):127 －31.

［3］Fishman D A，Kearns A，Chilukuri K，et al.Metastatic dissemination of human ovarian epithelial carcinoma is promoted by alpha2 beta1-integrin-mediated interaction with type I collagen［J］.Invasion Metastasis，1998，18(1):15 －26.

［4］Lalu M M，Csonka C，Giricz Z，et al.Preconditioning decreases ischemia/reperfusion-induced release and activation of matrix metalloproteinase-2［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，296(4):937－41.

［5］Mezentsev A，Seta F，Dunn M W，et al.Eicosanoid regulation of vascular endothelial growth factor expression and angiogenesis in microvessel endothelial cells［J］.J Biol Chem，2002，277(21):18670－6.

［6］Li Z，Zhan W，Wang Z，et al.Inhibition of PRL-3 gene expression in gastric cancer cell line SGC7901 via microRNA suppressed reduces peritoneal metastasis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，348:229 －37.

［7］Guidolin D，Vacca A，Nussdorfer G G，et al.A new image analysis method based on topological and fractal parameters to evaluate the angiostatic activity of docetaxel by using theMatrigel assayin vitro［J］.Microvasc Res，2004，67(2):117 －24.

［8］施有琴，王 榮，謝 華.沙立度胺抗腫瘤作用機制與臨床應(yīng)用研究進展［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26(8):993－4.

［8］Shi Y Q，Wang R，Xie H.Progress in the research of anti tumor mechanism and clinical application of thalidomide［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(8):993 －4.

［9］李玉娟，劉建勛.HIF-1活性調(diào)節(jié)及其在缺血后血管新生中的作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25(1):19－20.

［9］Li Y J，Liu J X.Key regulators of HIF-1 and its action in angiogenesis after ischemia［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(1):19 －20.

［10］Gasparini G，Longo R，Toi M，F(xiàn)errara N.Angiogenic inhibitors:a new therapeutic strategy in oncology［J］.Nat Clin Pract Oncol，2005，2(11):562－77.

［11］Egeblad M，Werb Z.New functions for the matrix metalloproteinase in cancer progression［J］.Nat Rev Cancer，2002，2(3);161.

［12］Hoyhtya M，Hujanen E，Turpeenniemi-Hujanen T，et al.Modulation of type-Ⅳcollagenase activity and invasive behavior of metastatic human melanoma(A2058)cellsin vitroby monoclonal antibodies to type-Ⅳ collagenase［J］.Int J Cancer，1990，46(2):282 －6.

［13］Chiang A C，Massague J.Molecular basis of metastasis［J］.N Eng Med，2008，359(26):2814

［14］Saaristo A，Karpanen T，Alitalo K.Mechanisms of angiogenesis and their use in the inhibition of tumor growth and metastasis［J］.Oncogene，2000，19(53):6122－9.

［15］Edwards J G，Cox G，Andi A，et al.Angiogenesis is an independent prognostic factor in malignant mesothelioma［J］.Br J Cancer，2001，85(6):863－8.

［16］Bamias A，Dimopoulos M A.Angiogenesis in human cancer:implications in cancer therapy［J］.Eur J Intern Med，2003，14(8):459－69.