彭乙華，曾恒禮，蔣 紅，蔡 燕，4，陳 敏，陳玉華，康后生，嚴(yán)宗遜

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川 南充 637000;2.富順縣第三人民醫(yī)院急診科，四川 自貢 6432013;3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫研究所，四川 南充 637000;4.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，四川 南充 637000)

糖尿病周圍神經(jīng)病變［1］(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病患者致殘的重要原因，嚴(yán)重影響人類健康。故加強(qiáng)對糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療具有重要意義。中醫(yī)中藥治療糖尿病周圍神經(jīng)病變歷史悠久，取得了一定的療效［2，3］，其中苦碟子注射液憑借其療效好、毒副作用低尤其受到臨床醫(yī)生的青睞，已廣泛用于治療糖尿病周圍神經(jīng)病變，但其具體機(jī)制尚不明確，故本實驗以不同濃度的苦碟子注射液處理人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC，探討苦碟子治療DPN 的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞:人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC 由本院風(fēng)濕免疫研究所保存。

1.1.2 試劑:RPMI1640 培養(yǎng)基(購自美國GIBCO);胎牛血清(購自杭州四季青公司)，使用濃度10%;MTT(購自美國sigma)，用0.1mol/L、pH 值為7.2 的磷酸鹽緩沖液配制為5mg/ml 于－20℃保存?zhèn)溆?DMSO 即二甲基亞砜(購自美國sigma);苦碟子注射液由本院藥房提供(10ml/支，通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z20025450))，4℃保存?zhèn)溆?，使用時以培養(yǎng)基稀釋。

1.1.3 儀器:酶標(biāo)儀(美國BD-RAD model 680 型)。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC 細(xì)胞用RPMI1640 培養(yǎng)基(加有10%的胎牛血清和終濃度皆為100U/ml 的青霉素及鏈霉素)于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為90%左右時用0.25%胰酶消化細(xì)胞，按每孔1000 個細(xì)胞左右(每孔終體積200μl)傳代至96 孔微量反應(yīng)板中繼續(xù)培養(yǎng)24 小時后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 藥物分組:將苦碟子按終濃度不同分為0μl/ml、 3.125μl/ml、 6.25μl/ml、 12.5μl/ml、25μl/ml、50μl/ml、100μl/ml 共7 組，其中0μl/ml 組為陽性對照組，余6 組為實驗組。藥物以培養(yǎng)基稀釋，每組設(shè)6 個復(fù)孔，另設(shè)不含細(xì)胞和藥物的空白對照孔和不加細(xì)胞僅加藥物的對照孔(以排除藥物對實驗結(jié)果的干擾)。

1.2.3 MTT 檢測:觀察96 孔微量反應(yīng)板中的細(xì)胞，24 小時后細(xì)胞基本貼壁，按以上分組情況加藥，小心吸取各培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液棄之。將含有不同濃度苦碟子注射液的培養(yǎng)液加至對應(yīng)組中，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后24 小時、48 小時進(jìn)行MTT 試驗:每孔加入5mg/ml 的MTT 溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 小時，2000r/m 離心10 分鐘后小心吸取上清棄之，每孔加入DMSO 150μl，振蕩10 分鐘使結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀上于波長490nm 處檢測各組吸光度值(OD值)。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

培養(yǎng)24 小時和48 小時后檢測，各處理組細(xì)胞吸光度值明顯高于對照組(0μl/m l)細(xì)胞的吸光度值，提示苦碟子具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，且隨藥物濃度增加促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)(見圖1)。對同一時間點的各組細(xì)胞吸光度值進(jìn)行單因素方差分析，差異有顯著性(p ＜0.05)(見表1)。

表1 不同濃度的苦碟子注射液處理HUVEC 細(xì)胞24 小時和48 小時后各組細(xì)胞吸光度值比較

3 討 論

糖尿病(diabetes，DM)是第三位威脅人類健康的重大非傳染性疾病，僅次于腫瘤、心腦血管疾病。我國目前約有3 千萬糖尿病患者，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活方式的改變有增加趨勢。作為糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥，DPN 的發(fā)生率高達(dá)60%-90%，主要臨床特征為肢體感覺和運(yùn)動神經(jīng)功能障礙，表現(xiàn)為肢體麻木、攣急疼痛、肌肉無力、腱反射減弱或消失等。并發(fā)難治性潰瘍、急慢性骨髓炎乃至敗血癥、肌肉萎縮和癱瘓、關(guān)節(jié)畸形等，病情遷延難愈，嚴(yán)重影響糖尿病病人生活質(zhì)量，是糖尿病患者致殘的主要原因，故應(yīng)加強(qiáng)對糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療。

目前研究發(fā)現(xiàn)DPN 的發(fā)病與機(jī)體代謝紊亂、維生素缺乏和微小血管病變引起的神經(jīng)缺血、缺氧有關(guān)［4］。DPN 患者多存在周圍血管的堵塞和血流不暢，并且病變區(qū)域還存在側(cè)支血管的建立不足，從而影響病變部位神經(jīng)、小血管和微血管的血液和營養(yǎng)供應(yīng)。王海燕等［5］將消渴痛痹顆粒通過灌胃的方式處理DPN 模型大鼠，發(fā)現(xiàn)該中藥方劑能促進(jìn)大鼠缺血組織的微血管再生，從而改善局部微循環(huán)障礙，減輕或改善了糖尿病周圍神經(jīng)病變。提示促進(jìn)血管再生、建立病變部位側(cè)支循環(huán)，以增加神經(jīng)和小血管的養(yǎng)供是藥物治療DPN 的機(jī)制之一。

苦碟子注射液是從中藥苦碟子中提取的富含腺苷、黃酮、異黃酮的復(fù)方制劑，具有抗血小板聚集、擴(kuò)張血管和改善微循環(huán)的作用?？嗟涌赏ㄟ^其疏通微循環(huán)的作用起到增加冠脈和腦血管血流量，在臨床上常用于治療不穩(wěn)定性心絞痛［6，7］、心力衰竭［8］、腦梗死［9，10］、糖尿病腎?。?1］等，并取得了一定的療效。研究者在臨床工作發(fā)現(xiàn)將苦碟子注射液與甲鈷胺聯(lián)用后可明顯改善糖尿病周圍神經(jīng)病變患者的癥狀和體征，說明苦碟子是治療DPN 的有效藥物，但其作用機(jī)制尚不明確。本實驗結(jié)果顯示不同濃度的苦碟子注射液作用HUVEC24 小時和48 小時后，MTT 檢測其吸光度值明顯高于未加藥物的對照組(p ＜0.05)，說明苦碟子注射液具有促進(jìn)HUVEC 增殖的作用。提示苦碟子注射液可能通過促進(jìn)HUVEC 增殖，從而促進(jìn)血管增生、側(cè)支循環(huán)建立，以改善病變部位血液供應(yīng)，達(dá)到改善DPN 患者的癥狀和體征的作用。

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