馮東岳 溫周瑞

1.全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站,北京 100125;2.湖北省水產(chǎn)科學研究所,武漢 430071

近年來,隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展,其在農(nóng)業(yè)產(chǎn)值中所占的比重也逐年上升,已成為中國農(nóng)業(yè)的四大支柱產(chǎn)業(yè)（糧食、肉類、水產(chǎn)和禽蛋）之一。據(jù)國家統(tǒng)計局統(tǒng)計,2009年我國漁業(yè)經(jīng)濟總產(chǎn)值11 445.13億元,漁業(yè)產(chǎn)值占農(nóng)林牧漁業(yè)總產(chǎn)值的9.32%,比2008年增長0.34%。2009年我國水產(chǎn)品總產(chǎn)量為5 116.40萬t,其中養(yǎng)殖產(chǎn)量為3 621.68萬t,占總產(chǎn)量的70.79%,可見養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)成為漁業(yè)經(jīng)濟的重要支柱。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大,養(yǎng)殖密度的不斷增大,發(fā)生病害的幾率也逐漸加大,每年造成的經(jīng)濟損失達100～150億元,病害已經(jīng)成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸因素之一。

水生動物的疾病包括病毒病、細菌病、真菌病和寄生蟲病等。其中病毒病的病原體微小、在宿主細胞內(nèi)復制、潛伏期長,導致病毒病癥狀復雜多變、傳染性強、死亡率高、難以防控,嚴重危害水生動物的養(yǎng)殖,易造成巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。國際動物衛(wèi)生組織OIE要求各成員國每年必須申報的水生動物疫病絕大部分是病毒病,如2010年要求必須報告的水生動物疫病有25種,其中病毒病16種、寄生蟲病6種、真菌病3種。因此,水生動物病毒病引起的危害越來越嚴重,已受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。

1 主要魚類病毒

自從Wolf分離到第一株魚類病毒（傳染性胰腺壞死病毒）[3]以來,迄今見報道的魚類病毒已超過70種,在絕大多數(shù)動物病毒科中都有分布[4]。其中有30多種魚類病毒分離成功,基本上屬于皰疹病毒科、呼腸孤病毒科、虹彩病毒科、副粘病毒科、雙RNA病毒等,表1列舉了一些對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害較嚴重的病毒。

表1 主要魚類病毒及其宿主

2 部分魚類病毒病的臨床癥狀

2.1 斑點叉尾鮰病毒病

病魚雙眼突出,魚體發(fā)黑、鰓發(fā)白,繼而表皮和鰭條基部充血,腹部膨大,還表現(xiàn)為行為異常,嗜睡,旋轉(zhuǎn)或垂直懸掛于水中,最后下沉死亡。解剖后可見肌肉充血,體內(nèi)有黃色滲出物,肝、脾、腎充血或腫大,胃內(nèi)無食物,后腎損傷較嚴重并出現(xiàn)水腫,最典型的組織病理變化是腎管和腎間組織的廣泛性壞死。

2.2 草魚出血病

病魚鰓充血、體發(fā)黑、眼突出,體表、口腔、鰓蓋和鰭條基部可見出血,撕開表皮可見肌肉點狀或塊狀出血。解剖后可見腸系膜、肝、脾、腎等內(nèi)臟出血,有的病魚的肝因失血而出現(xiàn)發(fā)黃癥狀。

2.3 傳染性造血器官壞死病

該病暴發(fā)時,稚魚和幼魚的死亡率突然升高。病魚表現(xiàn)為昏睡、頂水,行為異常,狂奔亂竄、打轉(zhuǎn)。病魚的眼球突出且變黑,鰓蒼白,腹部膨脹,鰭基部和頭部之后的側(cè)線處皮下出血,較為典型的特征是肛門拖一條不透明或棕褐色的假管型黏液樣糞便。

2.4 傳染性胰腺壞死病

病魚體色發(fā)黑,眼球突出,腹部膨大,腹部及鰭基部充血,鰓呈淡紅色,肛門處常拖有一條線狀黏液便。病魚還表現(xiàn)為游動失調(diào),常作垂直回轉(zhuǎn)運動,一會兒沉入水底,一會兒又重復回轉(zhuǎn)游動,直至死亡。解剖后可見消化道內(nèi)沒有食物,黏膜變性、壞死,肝、脾、腎水腫并異常蒼白,胰腺組織嚴重壞死。對胰臟組織進行超薄切片,可觀察到在細胞的胞漿中有包涵體存在。

2.5 真鯛虹彩病毒病

病魚未見異常則逐漸死亡。解剖后可見脾臟和腎臟腫大;脾臟和心臟組織內(nèi)出現(xiàn)真鯛虹彩病毒病常見的肥大細胞,但數(shù)量不多。病理組織學變化表現(xiàn)為脾髓、腎臟造血組織、肝臟有壞死病灶形成,各臟器血管和心臟有細胞浸潤發(fā)生。

2.6 錦鯉皰疹病毒病

病魚停止游泳,眼凹陷,皮膚上出現(xiàn)蒼白色的斑塊與水皰,鰓出血、黏液增多、組織壞死且有大小不等的白色斑塊,鱗片有血絲,體表黏液增多且變稠。病魚一般在出現(xiàn)癥狀后24～48 h內(nèi)死亡。

2.7 鯉春病毒血癥病

該病通常于春季（水溫20℃以下）暴發(fā),引起幼魚和成魚死亡。發(fā)病時,病魚行為失常,無目的地漂游,呼吸困難,體色發(fā)黑,眼球突出,腹部膨大,肛門紅腫,體表（皮膚、鰭條、口腔）和鰓充血。解剖時,全身出血、水腫、有大量的血性腹水,消化道出血,心、腎、鰾、肌肉出血并出現(xiàn)炎癥,最常見的是鰾內(nèi)壁出血。

2.8 病毒性出血性敗血癥

急性感染者表現(xiàn)為嗜睡,外觀色暗,實質(zhì)器官和肌肉出血以及游泳障礙和死亡。慢性感染時病魚表現(xiàn)冷漠或持續(xù)性死亡。解剖病魚可見肌肉、腸道出血,腎臟壞死,部分病魚腹腔中有腹水。

3 魚類病毒病的檢測和鑒定

目前,用于魚類病毒病檢測和鑒定的技術(shù)主要包括電子顯微鏡技術(shù)、細胞培養(yǎng)技術(shù)、免疫學技術(shù)、分子生物學技術(shù)和基因芯片技術(shù)等。

3.1 電子顯微鏡技術(shù)

目前,電鏡用于水生動物病毒的研究,其視野并不局限于觀察細胞病變、病毒的形態(tài)大小和分類,已擴展到了解病毒的感染、復制機理和病毒的形態(tài)發(fā)生等[5]。病毒囊膜的有無是水生動物病毒的基本結(jié)構(gòu)及分類特征之一,對此,電鏡觀察能提供直接證據(jù),如姜明等[6]用電子顯微鏡對一種真鯛球形病毒的形態(tài)及細胞病理學進行了觀察。徐洪濤等[7]通過電鏡觀察到了患虹彩病毒病的大菱鲆鰭、鰓、腎、脾、肝、胰、心及腦組織中的虹彩病毒病原,從而進行初步確診。

3.2 細胞培養(yǎng)技術(shù)

細胞培養(yǎng)技術(shù)是病毒學研究的基礎(chǔ),也是病毒病診斷的經(jīng)典方法之一。目前已建立的魚類細胞系很多,已有30余種魚類病毒在細胞培養(yǎng)中分離成功。國外已有利用培養(yǎng)細胞研究淋巴囊腫病毒（屬于虹彩病毒科）的報道。國內(nèi)左文功等[8]在1981年就開始進行草魚腎臟組織單層細胞的培養(yǎng),并利用此細胞分離到了草魚出血病的病毒顆粒。張奇亞等[9]通過建立呈上皮細胞形態(tài)的草魚椎骨間質(zhì)細胞系GCVB,表明GCVB細胞對蛙虹彩病毒中國分離株RGV9506及蛙虹彩病毒美國分離株FV3敏感,可引起不同程度的病變。呂宏旭等[10]利用牙鲆鰓細胞系進行了養(yǎng)殖牙鲆淋巴囊腫病毒的分離及培養(yǎng)。曾令兵等[11]采用細胞培養(yǎng)分離病毒技術(shù)從患出血病的斑點叉尾鮰體內(nèi)分離到一株新病毒,經(jīng)人工感染試驗、電鏡觀察、理化特性試驗以及病毒基因組分析,確認為斑點叉尾鮰呼腸孤病毒。

3.3 免疫學技術(shù)

免疫學技術(shù)包括中和實驗、熒光抗體技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）。中和實驗是魚類病毒鑒定中使用最為普遍的免疫學技術(shù),已成為魚類病毒鑒定的經(jīng)典方法,目前已廣泛應用于IPNV、PFRV、SVCV、VHSV、IHNV及CCV等的常規(guī)診斷。相比較而言,熒光抗體技術(shù)和ELISA可在幾小時之內(nèi)得到結(jié)果,從而可以滿足快速診斷的需要。熒光抗體技術(shù)目前已在 IPNV、VHSV、CCV、PFRV、SVCV及IHNV等的檢測中普遍使用,特別是若把細胞培養(yǎng)技術(shù)和熒光抗體技術(shù)結(jié)合起來,則可顯著提高熒光抗體技術(shù)的敏感性。ELISA目前亦用于IPNV、VHSV、CCV、PFRV 及 SVCV 的檢測。ELISA靈敏度高,特異性好,能同時進行大樣本檢測。江育林等[12]用ELISA達到了快速檢測虹鱒的傳染性胰臟壞死病病毒的目的。

3.4 分子生物學技術(shù)

分子生物學技術(shù)主要應用聚合酶鏈反應（PCR）,是一項DNA在體外合成的放大技術(shù)。根據(jù)PCR原理,人們研究出多種不同的PCR技術(shù),包括常規(guī)PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、套式PCR、熒光實時定量PCR技術(shù)等,并且已經(jīng)成功運用于檢測細菌和病毒。鄧敏等[13]根據(jù)真鯛虹彩病毒（RSIV）核苷酸還原酶小亞單位（RNRS）基因的高度保守區(qū)探索性地設(shè)計并合成一對引物,報道了鱖魚病毒的PCR檢測方法,可檢測到0.1 pg病毒DNA。苗素英等[14]用PCR方法檢測到虎紋蛙病毒中有虹彩病毒的存在。呂玲等[15]對一種蛙病毒進行酶切、PCR擴增后,通過比較酶切圖譜、PCR擴增產(chǎn)物,證明該病毒為蛙虹彩病毒屬的一種。范萬紅等[16]利用PCR的檢測方法,擴增蛙病毒屬衣殼蛋白（MCP）410 bp的DNA片段,用該方法從患“紅脖子”病的甲魚中分離的病毒毒株（9701株）中擴增出特異性的片段,經(jīng)比較分析初步判定9701株屬于蛙病毒屬。

3.5 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是一種高通量、快速、平行核酸序列測定及定量分析技術(shù)。它是在一塊大小不等的載玻片、硅片、尼龍膜等載體材料上,以大規(guī)模陣列的形式排布了不同的核酸探針,形成可以與目的靶分子相互作用,并進行反應的固相表面。通過與標記核酸分子雜交,用激光共聚焦熒光掃描儀或其他檢測手段檢測雜交信號強弱而判斷樣品中靶分子的組成及數(shù)量,該技術(shù)可以將大量的核酸分子同時固定在載體上,形成高通量檢測分析的能力,在大量樣品和多種病毒的檢測分析中有很大優(yōu)勢。許拉等[17]采用基因芯片技術(shù)原理,達到了在一個載體上同時檢測2個樣品和12種水生動物病毒的目的。這一技術(shù)在大批量病毒快速檢測中應用得非常廣泛。

4 魚類病毒病的防治

4.1 免疫預防

由于病毒病目前尚無較好的治療辦法,因而免疫接種就成為預防病毒病暴發(fā)、控制病毒病蔓延的主要手段。目前,國外已有數(shù)十種魚類病毒病疫苗商品化,而國內(nèi)魚類病毒病疫苗研究仍處于試驗階段,尚無商品化疫苗。魚類病毒病疫苗主要有滅活苗和弱毒苗2種。滅活疫苗研究較多,包括IPNV滅活苗、VHSV滅活苗、SVCV滅活苗及GCRV滅活苗等。弱毒苗中天然弱毒株很少,目前僅有一株自河鱸中分離到的IPNV,它對虹鱒安全無害,而且具有良好的免疫原性。弱毒苗能通過自然感染途徑進入魚體,除可誘導體液抗體產(chǎn)生外,還能產(chǎn)生局部免疫,因而免疫效果較好。但是,由于弱毒株具有回復突變的可能,因而在安全性上遠不如滅活苗。

4.2 藥物防治

有關(guān)魚類病毒病的化學藥物防治的資料不多。目前廣泛采用的是一種有機碘制劑（PVP）,已有資料表明,它能降低患傳染性造血器官壞死癥的紅點鮭幼魚的死亡率。據(jù)報道,PVP能有效破壞IHNV、IPNV和VHSV,因而常用于魚卵的消毒,但若病毒存在于卵膜內(nèi),用PVP處理也無效。此外,亦有資料表明,氯化銨可以抑制IPNV在CHSE-214細胞中增殖,苯丙咪唑鈉可抑制細胞的增殖,但均未進行魚體試驗。此外,天然植物藥物具有廣譜高效的抗病毒效果,開發(fā)天然植物抗病毒藥物,是未來水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病毒病防控技術(shù)研究的重要方向,且對于水環(huán)境安全、水產(chǎn)品質(zhì)量安全以及人類健康有重要意義。

4.3 嚴格執(zhí)行檢疫制度

限制把疫區(qū)的魚運到非疫區(qū)是控制病毒傳播的重要方法之一。因為疫區(qū)的魚,不管是患病魚,還是疫病流行后的存活魚,體內(nèi)的精液及卵液,多數(shù)都帶有病毒,一旦被引入非疫區(qū)的易感魚群,就會造成易感魚群的大量死亡。因此,在魚被引入新區(qū)之前,應進行嚴格的檢疫。有鑒于此,不少國家已制定并執(zhí)行了魚病法,制定了一些相應的有關(guān)魚類病原體檢測和鑒定的程序。中國頒布的動物檢疫條例中也包括了魚?。ㄖ饕遣《静。┑臋z疫,這標志著魚類病毒的研究進入了一個全新的階段。

5 魚類病毒病研究展望

今后魚類病毒病研究方向主要是快速診斷試劑盒的研制和疫苗的研發(fā)。應用現(xiàn)代分子生物學和免疫學技術(shù)可以達到早期和快速診斷的目的,隨著對魚類病毒分子生物學研究的不斷深入,尤其是DNA分離技術(shù)的提高、PCR技術(shù)的日趨完善、各種探針標記方法的發(fā)展,使得核酸檢測技術(shù)檢測各種病毒更為方便、安全、快捷,為快速診斷試劑盒的研制提供了技術(shù)基礎(chǔ)。同時,由于現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的發(fā)展,也為建立有效控制水生動物病毒病提供了新的方法和途經(jīng)。例如,對部分魚類病毒的基因組結(jié)構(gòu)已闡明,其編碼蛋白的性質(zhì)和功能也被初步揭示,這為定向抗病毒育種技術(shù)研究、抗病毒藥物篩選與應用等奠定了堅實的基礎(chǔ)。

從長遠看,研發(fā)免疫保護效果好的滅活疫苗以及研究新技術(shù)疫苗,如DNA疫苗、基因工程亞單位疫苗、載體表達口服疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗等,是未來魚類疫苗研制的發(fā)展方向。

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