隨晶晶，盧文彪，李茹柳，溫 鵬，胡 燦，趙世清，陳蔚文，2

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405;2上海市高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院，上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

多胺是一類(lèi)低分子非蛋白質(zhì)含氮化合物，主要有腐胺(putrescine，Put)、精脒(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)。它們廣泛分布在生物組織內(nèi)，具有多種生物學(xué)功能。多胺對(duì)腸粘膜上皮細(xì)胞的正常生長(zhǎng)發(fā)育及損傷后修復(fù)發(fā)揮著重要作用，是上皮細(xì)胞不同功能調(diào)節(jié)復(fù)雜信號(hào)通路的中心焦點(diǎn)［1-2］。胃腸上皮細(xì)胞構(gòu)成胃腸粘膜的保護(hù)屏障［3］，胃腸粘膜損傷后存在著修復(fù)過(guò)程，多胺對(duì)其修復(fù)過(guò)程中的細(xì)胞遷移、分化、增殖起關(guān)鍵性作用［4］。益氣健脾中藥可通過(guò)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶和多胺機(jī)制，促進(jìn)其修復(fù)過(guò)程中細(xì)胞遷移、分化、增殖等環(huán)節(jié)［5-7］。目前，多采用化學(xué)衍生 -高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定生物樣品中的多胺［8］。常見(jiàn)的衍生化試劑有鄰苯二甲醛、丹酰氯或苯甲酰氯等，對(duì)于苯甲酰氯衍生化條件的考察與優(yōu)化，以及IEC-6細(xì)胞中同時(shí)測(cè)定腐胺、精脒和精胺的檢測(cè)方法則未見(jiàn)報(bào)道。因此建立苯甲酰氯柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)多胺含量，觀(guān)察陽(yáng)性對(duì)照藥精脒對(duì)IEC-6細(xì)胞劃痕損傷后多胺含量的影響，為病理生理及藥理研究中檢測(cè)該細(xì)胞多胺提供參考。

1 儀器與材料

Agilent1200液相色譜系統(tǒng);3111型CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司);Hypersil ODS柱(大連依利特分析儀器有限公司)。

IEC-6細(xì)胞(大鼠小腸隱窩細(xì)胞，ATCC，Catalog No.CRL-1592，Lot.4988325)。高糖 DMEM(Lot.No.128000-017，GIBCO 公司)、Fetal Bovine Serum(FBS)(Lot.No.7211229，GIBCO 公司);胰酶(Lot.No.2716B052，Ameresco公司)、硫酸慶大霉素(Ameresco公司);胰島素(Cas.No.11070-73-8，Sigma公司);EDTA2Na·2H2O(廣州威佳科技有限公司);腐胺對(duì)照品(CAS.No.110-60-1;Lot:S53751459，Sigma公司)、精脒對(duì)照品(CAS.No.124-20-9;Lot:0001438791，Sigma公司)、精胺對(duì)照品(CAS.No.71-44-3;Lot:1309938，Sigma公司)。色譜甲醇(MERCK公司);超純水(Mili-Q Integral 3制備);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1多胺對(duì)照品的配制分別精密稱(chēng)取腐胺、精脒、精胺對(duì)照品 0.0101 g、0.0189 g、0.0282 g，加色譜甲醇溶解，分別定容于5 ml容量瓶，得腐胺、精脒、精胺濃度分別為 2.29 ×10-2、2.60 ×10-2、2.79×10-2mol·L-1的單一對(duì)照品貯備液。分別精密量取3種單一對(duì)照品貯備液各1 ml，置于1 L容量瓶中，加色譜甲醇稀釋至刻度，得腐胺、精脒、精胺濃度分別為2.29×10-5、2.60 ×10-5、2.79×10-5mol·L-1的對(duì)照品混合溶液。

2.2細(xì)胞樣品前處理待IEC-6細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%(培養(yǎng)皿底部80% ～90%面積有細(xì)胞生長(zhǎng))時(shí)，EDTA-胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，制作單細(xì)胞懸液，4 ×108cell·L-1種植于6 孔板，每孔2 ml。接種24 h后，吸棄培養(yǎng)液，用1 ml移液器吸頭沿孔中央輕輕做一直線(xiàn)劃痕，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞表面3次以去除細(xì)胞殘骸和碎片?？瞻捉M加入完全培養(yǎng)基每孔2.5 ml cDMEM;精脒組每孔2.5 ml cDMEM(含精脒5 μmol·L-1，簡(jiǎn)稱(chēng) SPD組)。每組6個(gè)復(fù)孔，合并2個(gè)復(fù)孔的細(xì)胞為一個(gè)樣，即每組3個(gè)樣。體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2，體積分?jǐn)?shù)為0.95的空氣，飽和濕度下37℃培養(yǎng)12 h后，棄廢液，PBS沖洗2次，每孔加入胰酶-EDTA消化液0.2 ml，37℃孵育5 min，每孔加入0.2 ml cDMEM終止消化后，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至1.5 ml EP管。3 000 r·min-1離心5 min，棄上清;加入PBS重懸后3 000 r·min-1離心5 min，棄上清;再次加入1 ml PBS重懸，取10 μl轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，余下細(xì)胞懸液3 000 r·min-1離心5 min，棄上清后加入冷高氯酸(體積分?jǐn)?shù)為 0.05)1.2 ml，混勻后 4℃、1 4000 r·min-1離心10 min。取上清液，供衍生化處理。

2.3衍生化處理取待測(cè)樣品溶液1 ml，分別加入2 mol·L-1的氫氧化鈉溶液1 ml和苯甲酰氯5 μl(含量≥96%)，渦旋混合后放置20 min，再加入飽和氯化鈉溶液2 ml和氯仿2 ml，渦旋混合1 min，3 000 r·min-1離心 10 min，吸取下層 1.5 ml有機(jī)相并氮?dú)獯蹈伞堅(jiān)?.5 ml的流動(dòng)相溶解在帶有螺蓋的玻璃管中，50℃下水浴保溫8 h，所得溶液分別加入2 mol·L-1氫氧化鈉溶液0.2 ml及氯仿2 ml，渦旋混合 1 min，3 000 r·min-1離心 10 min，吸取下層1.5 ml有機(jī)相并氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?.5 ml流動(dòng)相溶解，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜濾過(guò)，按擬定條件進(jìn)樣測(cè)定。

2.4色譜條件及專(zhuān)屬性驗(yàn)證ODS-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng):234 nm;柱溫:25℃;流動(dòng)相 ∶甲醇 ∶水(55∶45);流速:1.0 ml·min-1;進(jìn)樣量:20 μl。在建立的色譜條件下測(cè)定，各成分峰分離良好，腐胺、精脒和精胺的保留時(shí)間分別為7.2、13.7、27.6 min。細(xì)胞樣品未加衍生劑和衍生劑未加細(xì)胞樣品處理后，無(wú)相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)。結(jié)果見(jiàn)Fig 1～3。

2.5衍生化溫度考察按“2.3衍生化處理”項(xiàng)下方法，考察水浴溫度分別為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃時(shí)多胺的峰面積。結(jié)果見(jiàn)Tab 1。

Fig 1 HPLC chromatogram of polyamines after derivation

Fig 2 HPLC chromatogram of cell sample without derivative reagent

Fig 3 HPLC chromatogram of derivative reagent without cell sample

Tab 1 Polyamines peak areas in different water-bath temperature(xˉ±s，n=4)

2.6衍生時(shí)間的考察按“2.3衍生化處理”項(xiàng)下方法，考察水浴保溫時(shí)間分別為 1、2、4、6、8、10、12、14、16 h時(shí)的多胺峰面積(n=4)。結(jié)果見(jiàn)Fig 4。

Fig 4 Polyamines peak areas in different water-bath time

2.7線(xiàn)性范圍取對(duì)照品混合液(含腐胺4.80×10-5mol·L-1、精脒 4.065 × 10-5mol·L-1、精胺7.11 ×10-5mol·L-1)1 ml，按“2.3衍生化處理”項(xiàng)下方法處理，分別進(jìn)樣 1、2、5、10、15、20 和 25 μl進(jìn)行測(cè)定，以衍生化前樣品溶液濃度折算進(jìn)樣量(10-10mol)與峰面積進(jìn)行回歸，腐胺、精脒和精胺的回歸方程分別為^Y=8.2081X-0.5537，r2=0.9996;^Y=7.5388X-0.4558，r2=0.9995;^Y=6.3143X-0.2091，r2=0.9996，腐胺在0.054 ～1.35 nmol、精脒在 0.046 ～1.15 nmol、精胺在 0.080 ～2.00 nmol范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.8精密度實(shí)驗(yàn)分別精密配制對(duì)照品混合液高、中、低3個(gè)濃度，高濃度(含腐胺4.80×10-5mol·L-1;精脒4.065×10-5mol·L-1;精胺7.11×10-5mol·L-1);中濃度(含腐胺 3.20 ×10-5mol·L-1;精脒2.71 ×10-5mol·L-1;精胺 4.74 ×10-5mol·L-1);低濃度(含腐胺1.60×10-5mol·L-1;精脒1.355×10-5mol·L-1;精胺 2.37 ×10-5mol·L-1)。按“2.3”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定峰面積，日內(nèi)精密度:高、中、低濃度樣品各制備5份，當(dāng)日測(cè)定1次;日間精密度:高、中、低濃度樣品每隔24h測(cè)定1次，共測(cè)定3次。結(jié)果見(jiàn)Tab 2，3。

Tab 2 The intra-day precision of polyamines(n=5)

Tab 3 The inter-day precision of polyamines(n=5)

2.9回收率實(shí)驗(yàn)分別精密配制對(duì)照品混合液高、中、低3個(gè)濃度(同“2.8”項(xiàng)下)，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)Tab 4～6。

Tab 4 The method recoveries of putrescine(n=6)

Tab 5 The method recoveries of spermidine(n=6)

Tab 6 The method recoveries of spermine(n=6)

2.10細(xì)胞樣品測(cè)定細(xì)胞樣品按“2.2”和“2.3”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)Tab 7。

Tab 7 The polyamines contents in cell cultivated with spd.for 12 h(±s，n=3)

Tab 7 The polyamines contents in cell cultivated with spd.for 12 h(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control

＊＊

3 討論

多胺的衍生化條件考察結(jié)果表明，溫度對(duì)多胺的苯甲?；绊戄^大，40℃時(shí)精脒和精胺測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性較差，原因尚不明確，可能與該溫度下較有利于多胺之間的酶促轉(zhuǎn)化有關(guān)［2］;而在60℃時(shí)，副反應(yīng)增加，主要表現(xiàn)為對(duì)腐胺色譜峰分離度的影響，干擾測(cè)定。測(cè)定的多胺峰面積隨樣品的衍生化時(shí)間而變化較大，8 h時(shí)出現(xiàn)峰值，隨后又下降，這可能是多胺與苯甲酰氯之間的副反應(yīng)造成的，確切原因還有待深入研究。綜合考慮，選用50℃為衍生化溫度、8 h為衍生化時(shí)間。

方法學(xué)考察和細(xì)胞樣品測(cè)定結(jié)果表明，建立的多胺(腐胺、精脒和精胺)含量測(cè)定方法具有較好的準(zhǔn)確性，且較靈敏、簡(jiǎn)便，可作為細(xì)胞中多胺的分析檢測(cè)方法用于研究多胺對(duì)小腸上皮細(xì)胞增殖、遷移、分化、凋亡等方面的影響，以及研究藥物通過(guò)對(duì)多胺影響而發(fā)揮的藥理作用等方面。

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