王莉新，吳燕燕，王 易

(上海中醫(yī)藥大學(xué)免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室，上海 201203)

中醫(yī)臨床驗(yàn)方“芩部丹”(由黃芩、百部、丹參組方)系上海市龍華醫(yī)院邵長(zhǎng)榮醫(yī)生創(chuàng)立的抗癆方藥。據(jù)已有資料顯示，“芩部丹”作為醫(yī)院制劑用于治療對(duì)抗結(jié)核化療藥物產(chǎn)生耐藥性的開放性肺結(jié)核患者，痰菌陰轉(zhuǎn)率可高達(dá)47%;治療難治性肺結(jié)核患者，痰菌陰轉(zhuǎn)率可達(dá)34.5%，均見(jiàn)較明顯的臨床療效［1］。

但此方除方中黃芩被證實(shí)具有一定的抑制結(jié)核桿菌生長(zhǎng)作用外，其抗癆作用機(jī)制始終未能闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)通過(guò)對(duì)病原體相關(guān)分子模式(pathogenassociated molecular patterns，PAMPs)的識(shí)別而在固有免疫中發(fā)揮主導(dǎo)作用。已有研究表明這類受體在結(jié)核分枝桿菌入胞以及入胞后的轉(zhuǎn)歸中起重要作用［2］。其中TLR2與結(jié)核分枝桿菌入胞過(guò)程的關(guān)系尤為密切。故此實(shí)驗(yàn)研究設(shè)想，“芩部丹”臨床藥效的發(fā)揮，可能與其所含成分對(duì)TLR2受體在宿主細(xì)胞上之表達(dá)有關(guān)。此實(shí)驗(yàn)選取目前國(guó)內(nèi)可獲取之黃芩、百部、丹參的主要提取物黃芩苷(baicalin)、對(duì)葉百部堿(tuberostemonine)、丹參多酚酸鹽(salvianolate)作為研究對(duì)象，以觀察這些成分對(duì)TLR2的影響作用，揭示“芩部丹”可能的抗結(jié)核免疫藥理作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞及細(xì)菌人單核-巨噬細(xì)胞系U937，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫研究所惠贈(zèng);結(jié)核分枝桿菌H37Ra，由上海復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所惠贈(zèng)。

1.1.2藥物單體及主要試劑黃芩苷、對(duì)葉百部堿單體購(gòu)自上海同田生物技術(shù)有限公司;注射用丹參多酚酸鹽由上海綠谷制藥有限公司提供，100 mg·瓶-1;RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司;佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)購(gòu)自Promega公司;TRIzol reagent購(gòu)自 Invitrogen公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit和 SYBR Premix Ex TaqTM均購(gòu)自TaKaRa公司;PCR引物序列通過(guò)Oligo6軟件設(shè)計(jì)，并由生工生物工程(上海)有限公司合成;Anti-Human TLR2 FITC及對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照購(gòu)自eBioscience公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)用含體積分?jǐn)?shù)為0.10的ADC 7H9培養(yǎng)液，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周觀察1次，一般1～2周可見(jiàn)瓶底有顆粒生長(zhǎng)，10～15 d達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌用含有體積分?jǐn)?shù)為0.10的胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整濃度為 1 ×108·L-1。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)U937細(xì)胞按常規(guī)方法用含有體積分?jǐn)?shù)為0.10的胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將U937細(xì)胞密度調(diào)整為5×108·L-1，經(jīng)終濃度為100 nmol·L-1PMA刺激48 h后，分化為巨噬細(xì)胞(以鏡下細(xì)胞形態(tài)為確定依據(jù))。棄去培養(yǎng)液，重新調(diào)整細(xì)胞密度為1×109·L-1，2 ml/孔鋪于6孔板中，設(shè)對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、黃芩苷組(Baicalin)、對(duì)葉百部堿組(Tuberostemonine)、丹參多酚酸鹽組(Salvianolate)5組，每組3復(fù)孔。

1.2.3細(xì)胞感染模型的制備及藥物干預(yù)細(xì)胞和細(xì)菌按照上述方法培養(yǎng)后，于模型組及用藥組中，按照細(xì)胞∶細(xì)菌=10∶1加入細(xì)菌，將兩者共培養(yǎng)24 h，建立細(xì)胞感染模型。兩者共培養(yǎng)24 h后，換液，其中黃芩苷組、對(duì)葉百部堿組、丹參多酚酸鹽組換用含藥(終濃度為10 mg·L-1)的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待藥物作用8 h和24 h后，收集細(xì)胞，分別進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.4TLR2 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)收集藥物作用8 h后細(xì)胞，常規(guī)提取細(xì)胞總RNA。取細(xì)胞總RNA 5 μg，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，分別進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列如下:TLR2(F:CTGGCCAAAGTCTTGATTGAT，R:GACATTCCGACACCGAGAG);GAPDH(F:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，R:GGTGCTAAGCAG TTGGTGGT)。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán);95℃變性5 s，60℃ 退火20 s，共40個(gè)循環(huán)。用Rotor-Gene 6.0.38軟件讀取各個(gè)樣本的Ct值，結(jié)果以 2-ΔΔCt值表示。

1.2.5TLR2蛋白表達(dá)水平檢測(cè)收集藥物作用24 h后細(xì)胞，以FACS法檢測(cè)TLR2蛋白表達(dá)水平。按照說(shuō)明書加入適量Anti-Human TLR2，避光孵育30 min后，PBS洗兩次，以 200 μl含體積分?jǐn)?shù)為0.02多聚甲醛的PBS重懸細(xì)胞。于BD公司流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)并讀取數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以±s來(lái)表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1“芩部丹”對(duì)TLR2 mRNA表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組TLR2的mRNA表達(dá)水平降低(P＜0.05);與模型組相比，黃芩苷組、對(duì)葉百部堿組、丹參多酚酸鹽組TLR2的mRNA表達(dá)水平均增高(P＜0.05)。提示黃芩苷、對(duì)葉百部堿、丹參多酚酸鹽均可以糾正因結(jié)核分枝桿菌感染所造成之TLR2 mRNA表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象。見(jiàn)Fig 1，2。

Fig 1 The mRNA expression of TLR2 in U937

2.2“芩部丹”對(duì)TLR2蛋白表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組TLR2的蛋白表達(dá)水平降低(P＜0.05);與模型組相比，黃芩苷組、對(duì)葉百部堿組、丹參多酚酸鹽組TLR2的蛋白表達(dá)水平均增高(P＜0.05)。提示黃芩苷、對(duì)葉百部堿、丹參多酚酸鹽均可以糾正因結(jié)核分枝桿菌感染所造成之TLR2蛋白表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象。見(jiàn)Fig 3，4。

Fig 2 The amplification curve of TLR2 by RT-QPCR

Fig 3 The protein expression of TLR2 in U937

以上研究結(jié)果均提示，“芩部丹”中3種單體黃芩苷、對(duì)葉百部堿、丹參多酚酸鹽的臨床抗結(jié)核療效，有可能與其提高巨噬細(xì)胞表面受體TLR2表達(dá)的作用相關(guān)聯(lián)。

3 討論

自1994年發(fā)現(xiàn)人類TLRs以來(lái)，TLRs因其對(duì)病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的識(shí)別作用和介導(dǎo)多種免疫細(xì)胞激活的生物學(xué)效應(yīng)，日益受到免疫學(xué)界的關(guān)注。并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了較深入的研究。此外也發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)數(shù)量的藥物，尤其是中藥成分(多糖、黃酮、三環(huán)二萜類)對(duì)TLRs的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用［3］。這也促成了以TLRs為靶點(diǎn)治療感染性、免疫性疾病觀點(diǎn)的形成。TLR2與結(jié)核分枝桿菌入胞關(guān)系密切，并可識(shí)別結(jié)核分枝桿菌表面的阿拉伯糖甘露糖脂和磷脂酰肌醇甘露聚糖等，進(jìn)而激活抗原提呈，調(diào)節(jié)固有免疫及適應(yīng)性免疫［4-7］。有研究發(fā)現(xiàn)［8］，敲除小鼠 TLR2基因，然后讓小鼠感染結(jié)核分枝桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在感染2 h內(nèi)，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，并且IL-6、TNF和IL-12 p40分泌亦下降，說(shuō)明小鼠對(duì)結(jié)核分枝桿菌的易感性增加。同時(shí)，Harding等［9］發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌表面脂蛋白LpqH、LprG及LprA可與巨噬細(xì)胞表面TLR2結(jié)合，從而抑制APC MHCⅡ類分子表達(dá)，令A(yù)PC提呈抗原的能力下降，使結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活下來(lái)。這些現(xiàn)象均表明，TLR2在結(jié)核感染過(guò)程中起到了非常重要的作用。

Fig 4 The protein expression of TLR2 by FACS

王莉新等［10］在前期研究中發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽對(duì)人巨噬細(xì)胞表面的模式識(shí)別分子產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，而黃芩苷化學(xué)結(jié)構(gòu)亦屬于能夠?qū)逃忻庖吲c炎癥反應(yīng)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用的黃酮類?？紤]到這些已觀察到或已被文獻(xiàn)報(bào)道的藥效作用，推論所選取的芩部丹單體黃芩苷、丹參多酚酸鹽有可能影響人巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá)。出于同一推論，此實(shí)驗(yàn)亦曾對(duì)丹參酮ⅡA進(jìn)行相同研究，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)對(duì)TLR2表達(dá)的影響。此實(shí)驗(yàn)研究還顯示黃芩苷可直接提高人巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá)(結(jié)果另文發(fā)表)，而丹參多酚酸鹽與對(duì)葉百部堿僅表現(xiàn)為可拮抗因結(jié)核分枝桿菌感染所造成之TLR2蛋白表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象。提示此二者真正的作用部位可能是巨噬細(xì)胞內(nèi)對(duì)TLR2表達(dá)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路，今后將繼續(xù)就此開展深入研究。

中藥提取物用作體外細(xì)胞水平的藥效研究，其劑量確定是一個(gè)公認(rèn)的難題，因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)液中所添加的藥物含量很難對(duì)應(yīng)于臨床給藥劑量，本實(shí)驗(yàn)參照抗腫瘤藥物敏感性試驗(yàn)的相關(guān)文獻(xiàn)［11］。將單體含量按估算設(shè)置于臨床生藥用量范圍之內(nèi)，采用可觀察到陽(yáng)性結(jié)果的最低用藥量(因在不同提取物濃度作用條件下，靶細(xì)胞所測(cè)數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)典型劑量-反應(yīng)曲線)。其顯示的結(jié)果僅表明在設(shè)定實(shí)驗(yàn)條件下，所選用的中藥單體可對(duì)人巨噬細(xì)胞表面TLR2的表達(dá)產(chǎn)生影響。同時(shí)，因尚未發(fā)現(xiàn)可引起類似生物學(xué)作用的合適化合物，故實(shí)驗(yàn)未能設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，但這并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察的客觀性。

［1］薛鴻浩，張惠勇，鹿振輝，等.邵長(zhǎng)榮運(yùn)用芩部丹治療肺結(jié)核的經(jīng)驗(yàn)［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，34(6):520-1.

［1］Xue H H，Zhang H Y，Lu Z H，et al.The experience of Shao Chang-rong in curing tuberculosis with Qibudan［J］.J Shandong Univ TCM，2010，34(6):520-1.

［2］王莉新，王 易.Toll樣受體與結(jié)核分枝桿菌［J］.現(xiàn)代免疫學(xué)，2008，28(5):429-32.

［2］Wang L X，Wang Y.Toll-like receptors and mycobacterium tuberculosis［J］.Curr Immunol，2008，28(5):429-32.

［3］劉道芳，魏 偉，宋禮華.TLRs介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)信號(hào)通路及其藥物作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2005，21(6):653-6.

［3］Liu D F，Wei W，Song L H.Immunoregulation signal pathway mediated by TLRs and its drug role［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(6):653-6.

［4］Drage M G，Pecora N D，Hise A G，et al.TLR2 and its co-receptors determine responses of macrophages and dendritic cells to lipoproteins of Mycobacterium tuberculosis［J］.Cell Immunol，2009，258(1):29-37.

［5］Fang J，F(xiàn)ang D，Silver P B，et al.The role of TLR2，TLR3，TLR4，and TLR9 signaling in the pathogenesis of autoimmune disease in a retinal autoimmunity model［J］.Immunol Microbiol，2010，51，3092-9.

［6］Gilleron M，Quesniaux V F，Puzo G.Acylation state of the phosphatidylinositol hexamannosides from Mycobacterium bovis bacillus Calmette Guerin and mycobacterium tuberculosis H37Rv and its implication in Toll-like receptor response［J］.J Biol Chem，2003，278(32):29880-9.

［7］Noss E H，Pai R K，Sellati T J，et al.Toll-like receptor 2-dependent inhibition of macrophage classⅡMHC expression and antigen processing by 19-kDa lipoprotein of Mycobacterium tuberculosis［J］.J Immunol，2001，167(2):910-8.

［8］Feng C G，Scanga C A，Collazo-Custodio C M，et al.Mice lacking myeloid differentiation factor 88 display profoun defects in host resistance and immune responses to Mycobacterium avium infection not exhibited by Toll-like receptor 2(TLR2)-and TLR4-deficient animals［J］.J Immunol，2003，171(9):4758-64.

［9］Harding C V，Boom W H.Regulation of antigen presentation by Mycobacterium tuberculosis:a role for Toll-like receptors［J］.Nat Rev Microbiol，2010，8(4):296-307.

［10］王莉新，孫 煜，王 易.丹參多酚酸鹽對(duì)巨噬細(xì)胞抵抗素表達(dá)的影響［J］.中藥藥理與臨床，2009，25(6):45-7.

［10］Wang L X，Sun Y，Wang Y.Research on effects of salvianolate on expression of resintin［J］.Pharmacol Clin Chin Mater Med，2009，25(6):45-7.

［11］毛立民，于世鳳，孫開華，等.涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物敏感性的研究［J］.現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2000，14(1):19-21.

［11］Mao L M，Yu S F，Sun K H，et al.A study on chemosensitivity test of human salivary adenoid cystic carcinoma cell lines［J］.J Mod Stomatol，2000，14(1):19-21.