范 翰，李現(xiàn)麗，竇文芳，杜 斌，邱麗穎，金 堅(jiān)，許正宏

(江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

近年來糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其無法根治的原因是缺乏有效修復(fù)β細(xì)胞功能的藥物，GLP-1因能促胰島素釋放和促胰島細(xì)胞增殖而成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。但是GLP-1在體內(nèi)的半衰期極短，目前研究主要集中在以GLP-1為基礎(chǔ)的分子衍生物［1-2］上，現(xiàn)已有部分長效藥物被批準(zhǔn)用于臨床［3-4］。該研究前期利用分子生物學(xué)手段，將GLP-1突變體GLP-1A2G兩分子串聯(lián)后和人血清白蛋白(HSA)融合構(gòu)建長效融合蛋白GGH［5］，并對其進(jìn)行分離純化［6-7］。后期篩選和建立了一種β細(xì)胞輕度損傷模型，用于GGH及近年來新興的促β細(xì)胞增生類融合蛋白藥物療效的快速篩選、評價及作用機(jī)制的初步探討。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器STZ，Sigma公司;GLP-1單體，上海強(qiáng)耀生物工程公司;HSA，湖南紫光古漢南越制藥有限公司;Ex-4，Sigma公司;融合蛋白GGH，江南大學(xué)制藥工程實(shí)驗(yàn)室(HPLC檢測純度＞95%);碘［125I］胰島素放射免疫分析藥盒，北京市福瑞生物工程公司;小鼠增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體，鏈霉親和素-過氧化物酶(SABC)及DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。Freestyle血糖儀及檢測試紙條，美國雅培有限公司;冷凍離心機(jī)，日本Hitachi公司;Wizard 1470γ自動計(jì)數(shù)儀，美國Perkin Elmer儀器公司;切片機(jī)，德國特萊富公司。

1.2β細(xì)胞輕度損傷模型的建立健康♂C57BL/6小鼠16只，16～18 g，SPF級，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供〔SCXK(滬)2007-0005〕。按體質(zhì)量隨機(jī)分為NC組和STZ實(shí)驗(yàn)組，每組8只，實(shí)驗(yàn)前禁食14～16 h，次日尾靜脈取血測定FBG，實(shí)驗(yàn)組單劑量腹腔注射STZ 120 mg·kg-1，之后每周測定FBG，實(shí)驗(yàn)觀察期為5周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘取胰腺制備石蠟切片行HE染色。d 14的FBG在10～20 mmol·L-1且實(shí)驗(yàn)結(jié)束時恢復(fù)到正常水平的為成功β細(xì)胞輕度損傷模型，“成模率/%=成模小鼠只數(shù)/造模小鼠只數(shù)”，“恢復(fù)率/%=血糖恢復(fù)的小鼠只數(shù)/成模小鼠只數(shù)”。

1.3融合蛋白GGH的降糖藥效評價另70只C57BL/6小鼠腹腔注射STZ造模，14 d后將56只成模小鼠納入統(tǒng)計(jì)范圍，按FBG分為7組，每組8只:模型對照組(DM)、GLP-1對照組(0.07 mg·kg-1)、HSA對照組(2 mg·kg-1)、Ex-4 陽性對照組(0.1 mg·kg-1)、GGH 低、中、高劑量組(2、6、18 mg·kg-1，GGH 2、GGH 6、GGH 18)，并設(shè) NC 組。每天1次皮下注射，連續(xù)治療2周。每周1次禁食12 h測定FBG;實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1天小鼠進(jìn)入代謝籠，記錄飲食、飲水、尿量和體重變化數(shù)值;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠眼眶靜脈叢取血，收集血清樣本，測定血清胰島素水平;對胰島細(xì)胞做PCNA免疫組化，每張切片上、下、中、左、右處各選取1個胰島，共5個胰島，在400倍視野中計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，取平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1β細(xì)胞輕度損傷模型的建立STZ組d 14時成模率為88%，d 35時血糖均值與NC組比較差異無顯著性，恢復(fù)率為86%，見Fig 1。胰島HE染色，見Fig 2。d 14時NC組:胰島結(jié)構(gòu)清晰，邊緣清楚，細(xì)胞排列整齊，胞質(zhì)豐富;STZ組:胰島結(jié)構(gòu)較清晰，邊緣模糊，細(xì)胞分布較不均勻，細(xì)胞數(shù)目略有減少，說明給予STZ后引起了胰島結(jié)構(gòu)的輕度損傷，d 35時STZ組胰島自我修復(fù)較好，形態(tài)與NC組接近。故單劑量給藥STZ 120 mg·kg-1時C57BL/6小鼠成模率高，恢復(fù)率好，為下一步研究融合蛋白GGH降糖效果的理想模型。

2.2融合蛋白GGH的降糖藥效評價

2.2.1GGH對C57BL/6模型小鼠飲食、飲水、尿量和體重的影響見Tab 1。GGH低劑量組d 14時與DM、GLP-1、HSA組比較飲食量、飲水量減少(P均＜0.05)，GGH中、高劑量組飲食量、飲水量和尿量減少(P均＜0.05)，GGH高劑量組飲食量、飲水量和尿量與Ex-4組比較差異無顯著性(P均＞0.05);GGH各治療組體質(zhì)量d 14時與3組對照比較差異均無顯著性(這可能與C57BL/6小鼠的體重增長緩慢有關(guān))，與NC組比較均降低(P均＜0.05)。表明GGH在治療期內(nèi)對模型小鼠的“三多一少”癥狀有明顯改善，然而恢復(fù)到正常水平可能仍需要更長的時間。

Fig 1 Effect of STZ single administration on FBG level in C57BL/6 mice(±s，n=8)

Fig 2 Effect of STZ single administration on islet cells in C57BL/6 mice(HE×400)

Tab 1 Effect of GGH on diet，drinking water，urine volume and body weight in C57BL/6 models in two hours(±s，n=8)

Tab 1 Effect of GGH on diet，drinking water，urine volume and body weight in C57BL/6 models in two hours(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs NC;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs DM，GLP-1，HSA;#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ex-4

Group Diet/g·(10 g)-1 Drinking/ml·(10 g)-1 Urine/ml·(10 g)-1Weight/g NC 0.09±0.03 0.14±0.03 0.21±0.09 23.6±1.07 DM 0.48±0.06 1.67±0.20 1.38±0.17 22.0±1.24 GLP-1 0.47±0.04 1.75±0.31 1.30±0.17 22.2±0.88 HSA 0.49±0.05 1.70±0.28 1.25±0.14 21.2±1.47 Ex-4 0.39±0.10 0.69±0.13 0.45±0.12 22.1±0.57 GGH 2 0.40±0.08＊＊△# 1.37±0.36＊＊△## 1.08±0.34＊＊## 22.1±0.64＊＊GGH 6 0.37±0.12＊＊△ 1.25±0.39＊＊△## 0.99±0.20＊＊△△## 22.4±0.96*GGH 18 0.26±0.12＊＊△△ 0.73±0.15＊＊△△ 0.53±0.19＊＊△△ 22.3±0.94*

2.2.2GGH治療期內(nèi)對C57BL/6模型小鼠FBG的影響d 7或d 14時，GGH中、高劑量組與DM、GLP-1、HSA組比較，可明顯降低血糖濃度(P均＜0.01)，GGH高劑量組與Ex-4組降糖效果比較差異無顯著性 (P均＞0.05)，d 14時GGH高劑量組與Ex-4組血糖濃度基本恢復(fù)到正常值范圍。表明GGH的降糖效果較好，高劑量組與陽性對照組接近。見Fig 3。

Fig 3Effect of GGH on FBG level of C57BL/6 model mice(±s，n=8)

2.2.3GGH治療14 d后對C57BL/6模型小鼠FINS的影響d 14時GGH中、高劑量組FINS水平較DM、GLP-1、HSA組明顯升高(P均＜0.05)，GGH高劑量組與NC組、Ex-4組比較差異無顯著性(P均＞0.05)。表明皮下注射GGH后可通過刺激胰島素分泌而降低血糖濃度。見Tab 2。

Tab 2 Effect of GGH on FINS and the proliferation of islet cells in C57BL/6 models(ˉx ± s，n=8 or 5)

2.2.4免疫組化染色增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)與其特異性的抗體結(jié)合后呈現(xiàn)棕黃色顆粒，PCNA免疫染色基本完全著色于細(xì)胞核上，表現(xiàn)為彌散或顆粒形式或二者兼有，見Fig 4。NC組核內(nèi)著色較淺，這是因?yàn)檎顟B(tài)下處于動態(tài)平衡中的β細(xì)胞更新較少［8］;GGH中、高劑量組核內(nèi)棕黃色顆粒含量較豐富，著色較深，陽性細(xì)胞比例明顯高于NC、DM、GLP-1組(P均 ＜0.05，Tab 2);GGH 中、高劑量組與Ex-4組比較差異無顯著性(P＞0.05，Tab 2)。這一結(jié)果與 FBG、FINS一致，表明融合蛋白GGH可以通過促進(jìn)β細(xì)胞的增殖和胰島素的分泌而降低模型小鼠的高血糖水平。

Fig 4 Effect of GGH on PCNA immunohistochemistry of islet cells in C57BL/6 models(SABC×400)

3 討論

GLP-1是一種生理性肽類腸道激素，它與胰島β細(xì)胞上特異性的受體(GLP-1R)結(jié)合后，能夠提高β細(xì)胞對葡萄糖的敏感性，刺激β細(xì)胞中葡萄糖依賴的胰島素分泌，而且動物實(shí)驗(yàn)表明GLP-1可以促進(jìn)胰島新生［9］。但是，機(jī)體本身產(chǎn)生的活性GLP-1極易被降解，為了提高GLP-1的生物活性，實(shí)現(xiàn)其在體內(nèi)的長效作用，該研究前期利用白蛋白融合技術(shù)和基因工程手段，將GLP-1突變體GLP-1A2G兩分子串聯(lián)后和HSA進(jìn)行融合表達(dá)胞外分泌融合蛋白GGH，初步藥代動力學(xué)顯示小鼠體內(nèi)吸收半衰期為26.6 h，消除半衰期為 57.8 h［6］，克服了其易降解的缺點(diǎn)，然而是否保留天然GLP-1的功效還有待于證實(shí)。

為快速評價促β細(xì)胞增生類融合蛋白藥物的藥效及初步研究此類藥物的作用機(jī)制，參考糖尿病模型化學(xué)藥物的造模方法［10］，利用STZ輕度損傷小鼠胰島β細(xì)胞，使機(jī)體內(nèi)早期(1～2周)胰島素分泌不足，血糖值持續(xù)穩(wěn)定升高(2～4周)，后期(4～5周)通過胰島功能的自我修復(fù)使血糖水平恢復(fù)正常，從而建立可逆β細(xì)胞損傷模型，這在其他文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道。由于此模型小鼠的血糖濃度為一動態(tài)變化過程，因此選擇血糖水平維持較高的時段(2～4周)作為治療期，觀察GGH給藥后是否有更好的降糖效果或者是否縮短受損β細(xì)胞的修復(fù)時間，以此來評價GGH的降糖藥效。我們從2009年10月～2010年7月對小鼠進(jìn)行β細(xì)胞輕度損傷造模篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)♂C57BL/6小鼠單劑量腹腔注射STZ 120 mg·kg-114 d的成模率最高為88%，35 d的恢復(fù)率最好為86%，這為下一步研究融合蛋白GGH的降糖藥效提供了簡便理想的模型。

通過14 d治療發(fā)現(xiàn)，GGH治療組在飲食、飲水、尿量方面有明顯的減少;治療7 d時GGH高劑量組就已呈現(xiàn)明顯的降糖效果，治療期內(nèi)與Ex-4組的血糖恢復(fù)速度接近，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時兩組的血糖恢復(fù)時間也明顯縮短于3組對照組，這提示短期使用GGH可以達(dá)到控制高血糖癥狀的目的。通過對小鼠FINS的測定及胰島PCNA免疫組化的半定量表明GGH不僅能夠促進(jìn)胰島素分泌而且能夠促進(jìn)β細(xì)胞增殖，加速受損的β細(xì)胞恢復(fù)正常，而這正是傳統(tǒng)糖尿病治療藥物無法根治糖尿病的癥結(jié)所在，提示GGH在治療糖尿病方面有廣闊的發(fā)展前景。

綜上所述，我們認(rèn)為融合蛋白GGH模擬激活GLP-1R途徑發(fā)揮作用，即通過改善胰島細(xì)胞功能，增加胰島素的表達(dá)分泌及促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖從而達(dá)到降低血糖的目的。由此，GGH在克服了GLP-1易降解缺點(diǎn)的同時保留了其天然功效，這不僅對Ⅱ型糖尿病，而且對Ⅰ型糖尿病也具有肯定的治療作用，相信不久的將來GGH將會成為新型糖尿病治療藥物中的一員。

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