吉海杰，周 蕾，陳乃宏

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050;2.山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030012;3.中國藥科大學(xué)，江蘇南京 210009)

卒中(stroke)是一種突發(fā)性的以腦血液循環(huán)障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重危害到人類的健康。由于缺血大腦組織氧/能量代謝不足，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡引起行為功能的喪失或認(rèn)知缺陷。1970年P(guān)aniker等［1］提出氧化應(yīng)激的概念，指生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除失衡，導(dǎo)致其蓄積而引起的氧化損傷過程。生物體內(nèi)自由基包括氧自由基如超氧陰離子、羥自由基、單線態(tài)氧、過氧化氫和氮自由基如一氧化氮(NO)和亞硝基陰離子。正常情況下，自由基產(chǎn)生和清除保持平衡，但在缺血等病理條件下過量NO與超氧陰離子生成亞硝基陰離子，攻擊DNA、RNA和蛋白質(zhì)，引起基因突變、酶活性喪失以及細(xì)胞代謝紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和解體［2］，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。

依達拉奉(edaravone，EDA，化學(xué)結(jié)構(gòu)見Fig 1)是由日本開發(fā)并于2001年在日本上市，實驗室和和臨床研究表明EDA在急性腦梗死的治療中具有良好的神經(jīng)保護作用［3-5］。依達拉奉作為一種新型自由基清除劑對氧自由基［6-7］和氮自由基［8］均具有清除作用，本研究以硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)在水溶液中產(chǎn)生NO從而誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，觀察依達拉奉對PC12細(xì)胞的保護作用并對其機制進行初步研究。

Fig 1 Chemical structure of edaravone

1 材料與方法

1.1藥物與試劑依達拉奉，購自中國食品藥品檢定研究院，二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成0.1 mol·L-1的儲備液，實驗時用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度。硝普鈉、MTT購于Sigma公司;Annexin V-FITC/PI試劑盒，購于碧云天生物技術(shù)有限公司;DMEM培養(yǎng)基、馬血清及胎牛血清均購自美國Invitrogen公司;β-actin、Bax、Bcl-2 多克隆抗體為 Santa Cruz公司產(chǎn)品;其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心提供，培養(yǎng)于含5%胎牛血清和5%馬血清的DMEM培養(yǎng)基中，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3實驗儀器倒置顯微鏡(Nikon，日本)，流式細(xì)胞儀(BD，美國)，凝膠成像儀(Fuji，日本)。

1.4細(xì)胞模型建立及藥物處理待PC12細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至鋪滿單層后，輕輕吹打形成單細(xì)胞懸液，倒置顯微鏡下計數(shù)，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為108·L-1。將細(xì)胞接種在96孔板中，每孔100 μl。24 h后加入含不同濃度硝普鈉培養(yǎng)基，終濃度在300～800 μmol·L-1之間，共設(shè)6個濃度組。對照組加入DMEM完全培養(yǎng)液。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后MTT法測定細(xì)胞活力。

選擇細(xì)胞活力降低為正常值的50%～60%的硝普鈉濃度為后續(xù)造模條件。將細(xì)胞接種24 h后，造模同時加入25～125 μmol·L-1濃度的依達拉奉，共設(shè)5個濃度組。對照組加入DMEM完全培養(yǎng)液。

1.5MTT法檢測細(xì)胞存活率藥物處理24 h后，每孔加入5 g·L-1MTT 溶液10 μl，37℃孵育4 h 充分反應(yīng)生成甲臜，然后每孔加入三聯(lián)液100 μl，37℃孵育過夜充分溶解甲臜。測定570 nm吸光度(A)，根據(jù)公式計算細(xì)胞存活率(%):

1.6流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡細(xì)胞處理同前。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，胰酶消化、收集細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞3次，用PBS重懸細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為109·L-1，按Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書操作，然后在流式細(xì)胞儀上檢測。每組3個樣本，計數(shù)10 000個細(xì)胞，檢測結(jié)果使用Win MDI 2.8軟件分析。

1.7Western blot測定Bax與Bcl-2蛋白變化細(xì)胞處理同前。刮取細(xì)胞于3 000 r·min-1離心5 min，去上清，加入 100 μl細(xì)胞裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCl，150 mmol·L-1NaCl，1%NP-40，1 mmol·L-1PMSF，50 mg·L-1Leupeptin，1 mg·L-1pepstatin A，20 mg·L-1aprotinin，1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1NaVO3，50 mmol·L-1NaF，20 mmol·L-1pH 8.0)，提取總蛋白，BCA法測定樣品總蛋白含量。每組取總蛋白20 μg上樣，于15%SDS-PAGE電泳分離，電泳完畢轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，3%BSA室溫封閉2 h，加入Bax(1∶1 000)或Bcl-2(1∶500)或 β-actin(1∶1 000)于4℃孵育過夜，TBST洗5 min，3次，加HRP標(biāo)記羊抗兔或抗小鼠IgG(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗5 min，3次，ECL顯色，LAS-3000型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1依達拉奉對硝普鈉誘導(dǎo)PC12細(xì)胞存活率的影響本實驗采用梯度濃度硝普鈉與PC12細(xì)胞共孵育24 h，F(xiàn)ig 2A所示細(xì)胞活力隨著硝普鈉濃度的遞增而降低，本實驗選定硝普鈉500 μmol·L-1為造模條件進行后續(xù)研究。

細(xì)胞接種24 h后除空白組外其余均加入500 μmol·L-1硝普鈉，同時除模型組外其余加入不同濃度(25～125 μmol·L-1)依達拉奉，如 Fig 2B 所示依達拉奉能濃度依賴性增加PC12細(xì)胞的存活率，在濃度 75 μmol·L-1時達到峰值。

Fig 2 (A)Concentration-effect curve of sodium nitroprusside(SNP)on PC12 cells for 24 h(n=6).＊＊P＜0.01 vs normal(SNP=0).(B)Effects of edaravone(EDA)on PC12 cells viability injured by SNP(500 μmol·L －1)exposured for 24 h(n=6). ＊＊P＜0.01 vs model(EDA=0).

2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察如Fig 3所示，倒置顯微鏡下觀察正常PC12細(xì)胞貼壁、飽滿并呈多角形;而硝普鈉損傷后細(xì)胞變圓，細(xì)胞碎片增多。依達拉奉25 μmol·L-1和 75 μmol·L-1能明顯增加存活細(xì)胞數(shù)目，形態(tài)學(xué)表明依達拉奉對硝普鈉誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護作用。

2.3依達拉奉對氧化應(yīng)激PC12細(xì)胞凋亡的影響

流式直方圖中左下方表示正?；罴?xì)胞(Annexin V-和PI-)，右下方表示早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+和PI-)，右上方表示壞死和凋亡晚期細(xì)胞(Annexin V+和PI+)。如Fig 4所示，硝普鈉處理PC12細(xì)胞24 h后早期凋亡是細(xì)胞損傷的主要形式，由空白組的4.7%升高到模型組的57.2%，依達拉奉25 μmol·L-1和75 μmol·L-1給藥組分別減少至42.4%和26.4%，表明依達拉奉對硝普鈉誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡有保護作用。

Fig 3 Morphological analysis of PC12 cells by phase-contrast microscopy.

Fig 4 Protective effects of edaravone on PC12 cells apoptosis induced by sodium nitroprusside(500 μmol·L －1，24 h).

2.4依達拉奉對Bax與Bcl-2表達變化的影響如Fig 5所示，細(xì)胞經(jīng)500 μmol·L-1硝普鈉處理后與空白對照組比較，胞質(zhì)Bax表達明顯升高，Bcl-2表達明顯減少，從而使Bax/Bcl-2比值升高，表明細(xì)胞凋亡水平上升。與模型組相比，依達拉奉25 μmol·L-1給藥組Bax表達無明顯變化，Bcl-2表達略有升高，而75 μmol·L-1給藥組Bax表達明顯下降，Bcl-2表達明顯升高，表明細(xì)胞凋亡水平下降。

Fig 5 Effects of edaravone(EDA)on Bax and Bcl-2 expression in PC12 cells exposured to sodium nitroprusside(SNP，500 μmol·L －1)for 24 h.

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在神經(jīng)損傷機制研究中占有重要地位［9］。生理水平的NO是胞內(nèi)信使分子，其產(chǎn)生和消除處于平衡狀態(tài)，而在腦缺血情況下，NO在腦部堆積對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性損傷［10-11］。研究表明依達拉奉通過清除羥自由基及過氧亞硝酸鹽等自由基達到抑制脂質(zhì)過氧化的作用［12］，同時依達拉奉能降低誘導(dǎo)型NOS的表達從而減少氧化應(yīng)激反應(yīng)［13］。硝普鈉作為NO供體廣泛用于模擬腦缺血NO對神經(jīng)細(xì)胞損傷的體外研究，本實驗以硝普鈉誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，觀察依達拉奉的神經(jīng)保護作用。

本實驗利用MTT法測定線粒體酶的活力間接反映細(xì)胞活力。結(jié)果表明濃度超過400 μmol·L-1的硝普鈉與PC12細(xì)胞孵育24 h能明顯抑制MTT代謝率，說明硝普鈉釋放NO對細(xì)胞線粒體功能造成障礙;依達拉奉能濃度依賴性改善MTT代謝率，在75 μmol·L-1達到峰值，表明依達拉奉對硝普鈉釋放NO造成的線粒體損傷具有保護作用。形態(tài)學(xué)觀察表明500 μmol·L-1硝普鈉與PC12細(xì)胞孵育24h細(xì)胞變圓、碎片增多，表明細(xì)胞發(fā)生損傷;依達拉奉 25 μmol·L-1和 75 μmol·L-1組細(xì)胞碎片明顯減少，表明依達拉奉能增加存活細(xì)胞數(shù)目。在細(xì)胞凋亡研究中，Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡是較為常用、公認(rèn)的凋亡檢測方法，可區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡。硝普鈉處理PC12細(xì)胞24 h后早期凋亡是細(xì)胞損傷的主要形式，依達拉奉75 μmol·L-1組能減少早期凋亡細(xì)胞數(shù)目。

細(xì)胞的凋亡與抗凋亡之間存在一種精細(xì)的平衡，一旦這種平衡被打破，則可啟動細(xì)胞的凋亡程序，任何外界因素只要能激活凋亡啟動分子或降低凋亡啟動閾值均可促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生［14］。自由基可通過線粒體依賴途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2為抗凋亡蛋白，定位于線粒體上，其功能是維持線粒體膜的完整性，控制著線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔，其與凋亡蛋白Bax形成Bcl-2/Bax異二聚體使細(xì)胞免于凋亡，而Bax/Bax同二聚體則使細(xì)胞易于凋亡，因此Bcl-2/Bax的比值決定細(xì)胞對誘導(dǎo)凋亡信號的敏感性。實驗結(jié)果表明，硝普鈉誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Bcl-2表達下降，Bax表達上升，從而降低Bcl-2/Bax的比值;依達拉奉75 μmol·L-1給藥組與模型組比較Bcl-2表達上調(diào)，Bax表達下調(diào)，從而升高Bcl-2/Bax的比值，表明依達拉奉能抑制硝普鈉引起的細(xì)胞凋亡。

本實驗從細(xì)胞水平研究依達拉奉對硝普鈉誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的保護作用，結(jié)果表明依達拉奉能明顯增加硝普鈉處理PC12細(xì)胞活力，改善細(xì)胞形態(tài)，減少凋亡細(xì)胞比例，這可能與依達拉奉清除硝普鈉釋放NO，從而減少氧化應(yīng)激有關(guān)。

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