徐淑芬，田 燕，楊 杰，楊 立，李春美

(華中農業(yè)大學食品科技學院，湖北武漢 430070)

據(jù)統(tǒng)計，全世界有劇毒的眼鏡蛇的咬傷死亡率高達90%以上，而目前蛇毒的解毒藥物主要可分為抗蛇毒血清、化學解毒劑、植物藥、抗蛇毒蛋白4類。其中植物藥由于資源廣泛，生產技術相對簡單以及成本較低而受到各國學者的關注［1］。柿子是我國的傳統(tǒng)特色果品，柿子單寧具有抗氧化、抗腫瘤、解蛇毒等多種活性。植物單寧的生物活性與其聚合度緊密相關，由于柿子高分子量單寧是復雜混合物，其解蛇毒活性與聚合度的關系尚不清楚。本文研究了柿子單寧對眼鏡蛇蛇毒蛋白中酶活的抑制情況。并通過體內試驗研究單寧對染蛇毒小鼠存活時間的影響。旨在為深入研究柿子單寧的藥理作用，開發(fā)出安全有效的解蛇毒藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1原料與試劑羅田柿子購于華中農業(yè)大學農貿市場，眼鏡蛇毒蛋白粉購于浙江義烏市蛇類研究所，用SPF級昆明小鼠腹腔注射LD50為0.511 mg·kg-1。甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、β-巰基乙醇、四甲基乙二胺等購于美國Sigma公司，其它試劑均屬于國產分析純。

1.2動物SPF級，昆明種小鼠，體質量(20±2)g，♀♂各半，購自湖北省疾病預防控制中心實驗動物中心［湖北實驗動物質量合格證:SCXK(鄂)2008-0005］

1.3柿子單寧的制備按本實驗室的提取工藝，制得高分子量柿子單寧［2］，采用香草醛-硫酸法和蛋白質沉淀法對提取物中單寧的含量進行測定，含量均在95%以上。用Toyopearl HW-50F凝膠樹脂吸附后分別用體積分數(shù)為0.20、0.40和0.60的丙酮水溶液洗脫。依次分別收集后濃縮并冷凍干燥，得到3個柿子單寧級分，分別記為PT20、PT40、PT60。經硫解法［3］測定各個組分的平均聚合度(mDP)分別為2.61、23.27、33.37。

1.4柿子單寧對眼鏡蛇蛇毒蛋白中各種酶活力的影響用pH 7.6，濃度為0.05 mol·L-1的Tris-HCl緩沖液配置濃度為1 g·L-1的眼睛蛇毒溶液。將蛇毒溶液與單寧各級分溶液按不同的質量比20∶1、5∶1、1∶2混合，37℃保溫反應1 h，以10 000 r·min-1離心10 min，得到上清液備用。參考顧海峰等［4］的方法測定各上清液中磷脂酶A2酶、L-氨基酸氧化酶和乙酰膽堿酯酶活力。取20∶1、1∶2混合反應上清液分別記為S1和S2，沉淀分別記為C1和C2，進行SDS-PAGE電泳分析。

1.5柿子單寧對染眼鏡蛇毒小鼠致死毒性的影響昆明小鼠50只，♀♂各半，按體重隨機分成正常組，蛇毒組，單寧低、中、高劑量組(0.5、1.5、4.5 mg·kg-1)，每組 10 只。正常組腹腔注射生理鹽水，蛇毒組注射3 LD50眼鏡蛇毒溶液，給藥組先注射3 LD50的蛇毒溶液，再立即注射等量的單寧溶液作為中劑量組，給藥組低、中、高劑量比為0.3∶1∶3。觀察24 h內小鼠的死亡癥狀和死亡時間。

2 結果

2.1柿子單寧對眼鏡蛇蛇毒蛋白中各種酶活力的影響以眼鏡蛇粗毒中3種酶的活力分別為1計，不同聚合度、不同添加量的柿子單寧對蛇毒中3種酶活力的影響如Tab 1所示。隨著單寧含量增加，酶活降低，且呈明顯的劑量效應關系。這可能是由于隨著單寧濃度的增加，單寧與蛋白質結合方式和位點也會發(fā)生變化。當蛇毒與單寧質量比為1∶2的時候，酶活幾乎受到完全抑制。隨著聚合度的增加，PT20對酶活的抑制效果最差，PT40和PT60對酶活抑制效果相差不大，這可能是因為隨著聚合度增加，單寧與酶蛋白結合越強，當單寧分子量增加到一定的程度后，單寧對酶蛋白抑制程度受單寧分子量影響不大。

Tab 1 Inhibition of enzyme activity of Naja venom by PT fractions with different mean degree of polymerization

選擇PT40做SDS-PAGE電泳分析。粗毒液與1∶2沉淀中的蛋白質電泳圖幾乎完全一致，上清液中各組分蛋白質隨著單寧的增加顏色變淡，到1∶2的時候，上清液電泳圖中幾乎無蛋白質存在，表示當蛇毒與單寧質量比為1∶2時，PT40對蛇毒蛋白質沉淀效果較好。

2.2柿子PT40對眼鏡蛇毒染毒小鼠的體內解毒實驗模型組小鼠在注射蛇毒5～10 min后，運動失調，心跳加速，呼吸困難，眼瞼下垂，死亡前身體劇烈抽搐。給藥后，染毒死亡小鼠的平均存活時間明顯延長。但是單寧和蛇毒完全作用后，仍有蛇毒對機體造成損害，但是中毒癥狀得到明顯的減輕。

Tab 2 In vitro detoxifying effects of the PT 40 against Naja naja venom in mice

3 討論

單寧與蛋白質的結合是其最重要的特征，單寧要與蛋白質形成穩(wěn)定的復合體，其分子量是一個重要因素。本實驗研究表明，當眼鏡蛇毒與不同聚合度的柿子單寧以不同的質量比混合時，隨著單寧含量的增加，蛇毒中的磷脂酶A2、乙酰膽堿酯酶、L-氨基酸氧化酶酶活都受到了很大程度的抑制，且呈明顯的劑量效應關系，同時抑制效果隨單寧聚合度增加而增強。體內試驗也證明給藥組的小鼠死亡時間延長，存活率也提高，這說明注射柿子單寧對眼鏡蛇毒引起的毒害有一定的抑制作用。Borges等［7］曾報道芭蕉汁在體外對響尾蛇蛇毒蛋白中的磷脂酶A2、出血毒性、肌肉毒性都有抑制作用，但是在體內先注射蛇毒后，再注射藥物卻沒有解毒效果。這種差異可能是由于蛇毒的種類不同以及植物多酚與蛇毒的結合方式不同所造成的。柿子單寧與蛇毒蛋白質的結合機制和選擇性及其解蛇毒作用的藥理學機制還有待深入的研究。

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