楊潤梅，李金蓮，高南南，陳慧敏，蔡大勇，屠宴會

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理研究中心，北京 100193)

通過動物和人類臨床研究，動脈粥樣硬化被分為早期和晚期階段。1993年Ross首先提出動脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)損害和功能紊亂是動脈粥樣硬化最早期的特征性病變［1］，隨后經(jīng)大量研究得到證實。并發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化上述早期病變是可以逆轉(zhuǎn)的，而進(jìn)展后形成的纖維斑塊和粥樣斑塊病變則很難逆轉(zhuǎn)［2］，因此動脈粥樣硬化早期病變的診斷以及藥物的干預(yù)治療顯得尤為關(guān)鍵。

集中在動脈粥樣硬化早期階段的藥物的發(fā)現(xiàn)和評價需要一種適合的動物模型，10余年來，許多動物模型被用于動脈粥樣硬化研究，包括兔、猴、小型豬、轉(zhuǎn)基因動物等，它們共同存在造模周期長、灌胃不方便、來源困難、成本高等問題。

一個理想的研究早期動脈粥樣硬化的動物模型應(yīng)包括建模周期相對較短、性質(zhì)穩(wěn)定、重復(fù)性好，操作方便，同時應(yīng)具有與人近似的早期動脈粥樣硬化典型的病理改變，豚鼠顯示出了許多這些特性。豚鼠是為數(shù)不多的，像人類一樣以LDL為載體攜帶血液中大部分膽固醇的模型動物，此外，豚鼠還具有肝臟游離膽固醇較酯化膽固醇濃度高，合成和分解膽固醇比率適當(dāng)，及許多其它的與人的情況相似的特征［3］。目前國內(nèi)外對豚鼠早期動脈粥樣硬化模型及其形成機制的研究未見報道，因此本研究主要應(yīng)用高膽固醇飼料誘導(dǎo)方法，建立豚鼠早期動脈粥樣硬化模型，并對模型形成機制及其生物學(xué)特征進(jìn)行深入研究和探討，同時與大鼠模型進(jìn)行比較，為豚鼠模型在抗動脈硬化藥物研究中的應(yīng)用及其優(yōu)勢提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物Hartley豚鼠，♂，體質(zhì)量200～250 g，7～8周齡，來源于北京科宇動物養(yǎng)殖中心，生產(chǎn)許可證:SCXK(京)2008-0003。Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量 200～220 g，7～8周齡，來源于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證:SCXK(京)2007-0001。

1.2試劑血清TC(批號080411)、LDL-C(批號080151)測定試劑盒為中生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品。豚鼠CETP(批號301330221202)、大鼠 CETP(批號301330221111)、豚鼠 LP(a)(批號 301330012331)、大鼠 LP(a)(批號301330012001)、豚鼠 ox-LDL(批號 3013221031111)、大鼠ox-LDL(批號3013031031233)酶聯(lián)免疫試劑盒均為美國ADL公司進(jìn)口產(chǎn)品。兔抗大鼠PCNA抗體(批號091028)、CD36抗體(批號091010)、VCAM-1抗體(批號091022)、二抗試劑盒(批號SP-0023)、DAB顯色液(批號C-0010)，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。兔抗豚鼠PCNA抗體為Minipoer產(chǎn)品;兔抗豚鼠CD36、VCAM-1抗體均為UCL公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品。

1.3儀器日立7060型全自動生化分析儀;Fluko F6/10型組織勻漿機;DM-V型自動組織包埋機;Leica RM2016型石蠟切片機;Leica DM4000B生物顯微鏡;Bio-RAD MQX200微孔板掃描酶標(biāo)儀。

1.4實驗方法將豚鼠和大鼠隨機分成對照和模型組，分別定量飼喂常規(guī)顆粒飼料和高脂飼料(質(zhì)量構(gòu)成比為膽固醇0.01、豬油0.10，常規(guī)飼料0.89)。于實驗第6周處理動物，烏拉坦麻醉后股動脈取血，離心分離血清酶法檢測TC、LDL-C水平，ELISA測定CETP、LP(a)和ox-LDL含量。剖取肝左大葉，酶分析法測定肝臟ACAT活性(以油酰輔酶A和膽固醇為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，產(chǎn)物用DTNB顯色定量用于計算ACAT活性)。分離主動脈，固定于體積分?jǐn)?shù)為0.10的甲醛溶液中，乙醇梯度脫水，取主動脈弓部，石蠟包埋，4 μm切片，H＆E染色。低倍鏡下(×200)，取完整主動脈弓部的橫斷面。LAS采圖，用Image pro plus 6.0分別測量外彈力板以內(nèi)面積(S1)及管腔面積(S2)，按R=(S1-S2)/S1計算內(nèi)膜-中膜面積構(gòu)成比，以此換算出內(nèi)膜-中膜厚度變化。高倍鏡下(×400)每個切片隨機選取5個視野，計數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)彈力板以外范圍的炎性細(xì)胞核總數(shù)，主要是浸潤與局部增生的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并觀察脂斑形成情況(表現(xiàn)為內(nèi)含大量脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞聚集和堆積)。

應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法測定主動脈壁PCNA、CD36及VCAM-1蛋白表達(dá)。高倍鏡(×400)下每個標(biāo)本隨機選取9～10個視野，使用專業(yè)采圖軟件LAS采集圖片，分析軟件Image pro plus 6.0分別測定動脈壁PCNA、CD36和VCAM-1陽性表達(dá)的平均光密度值(OD)、陽性染色面積(AP)以及觀察視野區(qū)面積(AT)，以單位體積內(nèi)膜細(xì)胞陽性表達(dá)平均光密度值變化表示動脈壁PCNA、CD36和VCAM-1蛋白表達(dá)的變化(通過公式MOD=［OD×(AP/AT)3/2］計算)。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行非獨立樣本t檢驗。

2 實驗結(jié)果

2.1血清TC、LDL-C、CETP、LP(a)、ox-LDL濃度及肝臟ACAT活性變化高脂飼料誘導(dǎo)6周后，豚鼠血清TC、LDLC水平明顯升高，比對照組分別升高11.13倍和7.82倍;大鼠模型組血清TC和LDL-C較對照組分別升高2.00倍和3.16倍，明顯低于同期豚鼠模型組。此外，豚鼠血清CETP、LP(a)水平，ox-LDL表達(dá)，肝臟ACAT活性均較對照組明顯增強(P＜0.05，P＜0.01)，而相同高脂飼料誘導(dǎo)下大鼠上述指標(biāo)均未出現(xiàn)明顯變化，見Tab 1、2。2.2主動脈形態(tài)學(xué)變化豚鼠與大鼠正常對照組動脈內(nèi)膜完整光滑無損傷，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊，厚薄均勻，少見單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞黏附和浸潤。高脂飼料誘導(dǎo)6周后豚鼠模型組動脈內(nèi)皮細(xì)胞水腫、脫落，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂，部分平滑肌細(xì)胞水腫和增殖，內(nèi)膜-中膜厚度與對照組比較明顯增加。沿內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附較多單核細(xì)胞;內(nèi)膜出現(xiàn)大量單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞聚集。此外有比例為0.40的動物動脈內(nèi)膜出現(xiàn)脂紋脂斑，表現(xiàn)為大量泡沫細(xì)胞聚集成堆，周邊可找到單核巨噬細(xì)胞，但病灶內(nèi)未出現(xiàn)變性的膠原纖維帽，該病變屬于動脈粥樣硬化的脂紋脂斑期。而大鼠模型組動脈內(nèi)膜較完整平坦，內(nèi)皮黏附及浸潤于內(nèi)膜的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞少于豚鼠模型組，且無一例出現(xiàn)脂質(zhì)斑塊，見 Fig 1、2。

Tab 1 Changes of serum TC，LDL-C concentration in guinea pigs and rats fed with high lipid diets for 6 weeks(ˉx ± s，n=10)

Fig 1 ⅠInflammatory cell infiltration in animals fed with control and high lipid diets for 6 weeks(±s，n=10)＊＊P＜0.01 vs control.ⅡRepresentative photomicrograph of HE staining in different groups(HC×400)A:Rat control group;B:Rat model group;C:Guinea pigs control group;D:Guinea pigs model group(As shown，aortic intima-media area significantly thickened，inflamatory cells aggregated and fatty streak developed)

2.3主動脈PCNA、CD36及VCAM-1蛋白表達(dá)變化高膽固醇飼料誘導(dǎo)6周后，豚鼠模型組主動脈內(nèi)膜PCNA(陽性細(xì)胞的細(xì)胞核染成黃褐色)、CD36和VCAM-1(陽性細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染成黃褐色)表達(dá)較正常對照組明顯增多(P＜0.05);而相同誘導(dǎo)周期的大鼠模型組動脈內(nèi)膜PCNA、CD36及VCAM-1表達(dá)均未發(fā)生明顯改變，見Fig 3。

Tab 2 Changes of serum CETP，LP(a)，ox-LDL concentration and hepatic ACAT activities in guinea pigs and rats fed high lipid diets for 6 weeks(±s，n=10)

Tab 2 Changes of serum CETP，LP(a)，ox-LDL concentration and hepatic ACAT activities in guinea pigs and rats fed high lipid diets for 6 weeks(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Animal Group CETP/μg·L-1 LP(a)/μg·L-1 ox-LDL/mg·L-1 ACAT/nmol·g-1·min -1 Guinea pig Control 15.64±7.27 3.01±0.47 3.29±0.85 306.40±12.36 Model 21.88±4.31* 4.02±1.25* 4.00±0.55* 345.09±18.23＊＊Rat Control 4.77±1.54 3.37±0.81 3.81±1.41 326.62±12.86 Model 4.69±2.15 2.51±0.70 4.67±1.08 322.14±12.11

Fig 2ⅠChanges of aortic intima-media area constituent ratio in animals fed on high lipid diets for six weeks(±s，n=10)*P＜0.05 vs control group.ⅡRepresentative photomicrograph of aorta from guinea pigs and rats in different groups (H﹠ E×50)，the scale bar represents 25 μm. A:Rats control group;B:Rats model group;C:Guinea pigs control group;D:Guinea pigs model group(As shown，aortic intima-media area significantly thickened)

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)豚鼠經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)6周后主動脈壁已具有早期動脈粥樣硬化典型病理特征，而相同高脂飼料及相同誘導(dǎo)周期的大鼠，動脈未出現(xiàn)類似病理改變。說明豚鼠在高脂飼料誘導(dǎo)下比大鼠易于形成動脈粥樣硬化病變。

動脈粥樣硬化發(fā)病機制十分復(fù)雜，其中膽固醇酯化過程是動脈粥樣硬化產(chǎn)生的初始環(huán)節(jié)。ACAT是細(xì)胞內(nèi)唯一的催化游離膽固醇形成膽固醇酯(Cholesterolester，CE)的酶。在肝臟和小腸細(xì)胞中，ACAT還參與脂蛋白裝配［4］，對VLDL及apoB100分泌起促進(jìn)作用，可直接影響血液中膽固醇水平。在單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞后，ACAT1大量表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的過量堆積被巨噬細(xì)胞吞噬形成泡沫細(xì)胞。因此ACAT是近年來研究降膽固醇和抗動脈粥樣硬化藥物的一個新的靶酶［5］。研究結(jié)果顯示，豚鼠模型組肝臟ACAT活性較正常組明顯升高，其膽固醇酯化能力及脂蛋白生成能力增強，因此表現(xiàn)出血清TC和LDL-C水平明顯上升，且升高幅度遠(yuǎn)高于大鼠，在短期內(nèi)形成了早期動脈粥樣硬化病變，而大鼠模型組肝臟ACAT活性未見明顯變化，因此其高脂血癥及動脈粥樣硬化癥狀不如豚鼠模型明顯。

Fig 3 Changes of PCNA，VCAM-1 and CD36 expression in guinea pigs and rats for 6 weeks

CETP是一種疏水性糖蛋白［6］，可介導(dǎo)脂蛋白之間脂質(zhì)的交換，使 CE從 HDL向 VLDL、LDL轉(zhuǎn)運。CETP活性增加，CE轉(zhuǎn)運速率加快，更多富含CE的LDL和VLDL殘粒積聚于血漿，當(dāng)透過動脈壁時，過多的LDL積聚于動脈壁細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致CE沉積，促進(jìn)動脈粥樣硬化形成［7］。本實驗結(jié)果表明，豚鼠正常組血清CETP表達(dá)水平明顯高于大鼠，與文獻(xiàn)報道一致［8］，即與人的CETP表達(dá)活性相近。經(jīng)高膽固醇飼料誘導(dǎo)后，其血清CETP表達(dá)明顯高于對照組，而大鼠無明顯變化。此結(jié)果表明高脂飼料誘導(dǎo)活躍了豚鼠體內(nèi)脂質(zhì)交換，導(dǎo)致豚鼠血清出現(xiàn)大量富含CE的LDL和VLDL，這類脂蛋白極易被氧化修飾，并被巨噬細(xì)胞吞噬形成泡沫細(xì)胞，進(jìn)而在動脈內(nèi)膜聚集形成脂紋脂斑，這是豚鼠脂代謝紊亂及動脈粥樣硬化病變的主要機制及生物學(xué)特征。

LP(a)是一種存在于血清中的特殊脂蛋白，其中Apo(a)是LP(a)的特征性糖蛋白成分，并通過二硫鍵與中心脂質(zhì)上ApoB100相連接。研究發(fā)現(xiàn)，LP(a)水平升高可促進(jìn)其所攜帶CE被血管壁細(xì)胞攝取利用，進(jìn)而被單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞攝取，最終促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，因此被認(rèn)為是動脈粥樣硬化的一個獨立危險因子［9］。實驗結(jié)果提示，豚鼠脂紋脂斑的形成可能與高膽固醇飼料引起的血清LP(a)升高存在極其密切的關(guān)系。因此，兩種動物之間血清LP(a)變化出現(xiàn)的差異性，可能是豚鼠較大鼠更易于形成早期動脈粥樣硬化病變的另一個重要機制。

高脂血癥時血漿中急劇升高的LDL易被氧化修飾形成ox-LDL，后者不能被肝臟LDL受體攝取進(jìn)行代謝。ox-LDL可直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞引起動脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)損傷和功能紊亂，另一方面通過內(nèi)皮細(xì)胞膜受體介導(dǎo)而被巨噬細(xì)胞吞噬發(fā)展形成泡沫細(xì)胞，從而引發(fā)動脈內(nèi)膜脂紋脂斑形成［10］。

CD36是B類清道夫受體家族的成員，是巨噬細(xì)胞表面識別、吞噬ox-LDL的主要受體，CD36還可介導(dǎo)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，促進(jìn)單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞遷移和聚集，在那里分化形成巨噬細(xì)胞，不斷吞噬ox-LDL的巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，造成脂質(zhì)在血管壁堆積，因此，CD36受體是巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL形成泡沫細(xì)胞的關(guān)鍵［11］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高膽固醇飼料誘導(dǎo)豚鼠6周時即可顯著升高血清ox-LDL水平，同時主動脈內(nèi)皮CD36蛋白表達(dá)較正常對照組明顯增強，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞大量吞噬ox-LDL，進(jìn)而形成泡沫細(xì)胞堆積在動脈內(nèi)皮表面。而大鼠模型組ox-LDL升高不如豚鼠模型明顯，動脈壁CD36蛋白表達(dá)未見明顯變化，因此未觀察到動脈內(nèi)皮泡沫細(xì)胞聚集形成的脂紋脂斑。

近期已有相關(guān)研究證實［12］，發(fā)生動脈粥樣硬化病變時不僅存在脂代謝紊亂，同時也存在慢性炎癥反應(yīng)過程［13］，VCAM-1主要在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，可選擇性促進(jìn)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮黏附［14］，是單核細(xì)胞向動脈壁遷移過程中起關(guān)鍵作用的黏附分子。

本次實驗發(fā)現(xiàn)，高脂飼料誘導(dǎo)后的豚鼠模型組動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞脫落，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞黏附較多的單核細(xì)胞，內(nèi)膜也有大量單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤與聚集，與正常對照組相比，差異存在顯著性。同時免疫組化研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，VCAM-1在動脈壁病灶中大量表達(dá)，以上結(jié)果提示豚鼠早期動脈粥樣硬化病變存在炎癥反應(yīng)過程，相比之下，大鼠模型組動脈內(nèi)皮少見單核細(xì)胞黏附，內(nèi)膜單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤較少，同時主動脈壁VCAM-1蛋白表達(dá)增強不明顯，表明其炎癥反應(yīng)不如豚鼠強烈，因此內(nèi)皮細(xì)胞損傷后過度釋放VCAM-1可能是動脈粥樣硬化發(fā)生機制之一，也是大鼠不如豚鼠易于形成早期動脈粥樣硬化的重要原因之一。

PCNA是一種細(xì)胞核內(nèi)酸性蛋白質(zhì)，在細(xì)胞分裂時協(xié)調(diào)DNA引導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成，對細(xì)胞分裂及增殖起重要作用。檢測血管壁PCNA的表達(dá)，能較好地反應(yīng)血管細(xì)胞的增殖活性［15］。

本次實驗發(fā)現(xiàn)，豚鼠模型組動脈壁PCNA陽性表達(dá)較正常組明顯升高，表明經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)后，豚鼠血管細(xì)胞的增殖活性明顯增強，中膜平滑肌細(xì)胞增生明顯，并發(fā)生向內(nèi)膜的遷移，最終導(dǎo)致內(nèi)膜-中膜增厚。大鼠模型組動脈PCNA表達(dá)及內(nèi)膜-中膜厚度未發(fā)生明顯的改變。因此，PCNA表達(dá)的增強可能與豚鼠模型組內(nèi)膜-中膜增厚的病理機制有密切關(guān)系。

以上研究表明，豚鼠攝入高膽固醇飼料6周后可形成早期動脈粥樣硬化損傷，其病理機制主要反應(yīng)在促發(fā)動脈粥樣硬化形成過程中發(fā)揮重要作用的酶、蛋白、受體、黏附分子等發(fā)生了明顯改變，是豚鼠易形成早期動脈粥樣硬化的主要機制，也是相同誘導(dǎo)條件下大鼠不易形成動脈粥樣硬化的主要原因。因此，豚鼠作為早期動脈粥樣硬化動物模型的使用可能具有若干優(yōu)勢，尤其是對發(fā)現(xiàn)和評價作用于ACAT、CETP、LP(a)、CD36、VCAM-1等靶點的新類型藥物，豚鼠可能是一種較為理想的動物模型。

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