趙莉萍，梅 俏，許建明，姚 強，金 娟

(1.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內科，安徽省消化病重點實驗室;安徽合肥 230022;2.安徽淮北職業(yè)技術學院醫(yī)學系，安徽淮北 235000)

非甾體類抗炎藥(NSAIDs)是歐美國家引起藥物性肝損傷的主要因素，雙氯芬酸鈉和舒林酸較為常見［1-2］。研究表明［3］，雙氯芬酸鈉引起肝損傷與線粒體功能受損有關，線粒體通透性改變(mitochondrial permeability transition，MPT)在雙氯芬酸鈉誘導的肝損傷中具有重要作用，MPT可導致活性氧物質生成和線粒體腫脹等引起肝細胞壞死［4］。藥物性肝損傷除及時停藥外，目前尚無有效治療藥物。地塞米松是一種糖皮質激素，具有抗炎和抑制免疫作用，對氨基半乳糖、內毒素、四氯化碳等所致急性肝損傷具有保護作用［5］。臨床上有肝臟切除圍手術期使用地塞米松和治療藥物性肝損傷的部分研

1 材料

1.1動物Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，清潔級，♀、♂各半，體質量(230±20)g，南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供。室溫、光照周期12 h:12 h條件下飼養(yǎng)1周后使用。

1.2藥物與試劑雙氯芬酸鈉(didofenac，Dof)為美國Sigma公司產(chǎn)品，羅丹明123為Solarbio生物公司產(chǎn)品，地塞米松(dexamethasone，Dex)為山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathion，GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、線粒體琥珀酸脫氫酶(SDH)和ATPase活力測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

2 方法

2.1大鼠藥物性肝損傷模型的制備參照文獻方法［7］，取 SD 大鼠，禁食12 h，自由飲水，雙氯芬酸鈉100 mg·kg-1腹腔注射1次，建立雙氯芬酸鈉誘導大鼠急性肝損傷模型。

2.2給藥方案SD大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、地塞米松給藥組(10mg·kg-1)，采用腹腔注射方式給藥，地塞米松于雙氯芬酸鈉注射前1 h給予1次，正常對照組及模型對照組均給予生理鹽水注射。

2.3檢測方法雙氯芬酸鈉注射24 h后大鼠取血分離血清測定ALT及AST水平。行肝臟灌流，取肝臟組織用冰生理鹽水制成肝勻漿，肝勻漿MDA、GSH水平和SOD、GSH-Px含量分別按試劑盒操作要求進行檢測。取相同部位肝臟組織固定于4%甲醛液中，行HE染色。另迅速分離、稱量肝組織1 g，置于預冷的0.25 mol·L-1蔗糖溶液中，按每克肝加9 ml線粒體分離液制成10%肝勻漿，按文獻方法制備肝線粒體［8］。線粒體膜電位采用羅丹明方法檢測［9］，線粒體腫脹度采用線粒體在520 nm處吸光度降低值檢測［10］，NADH水平采用 NADH熒光度檢測［11］。線粒體SDH及ATPase含量按試劑盒操作要求進行檢測。

2.4統(tǒng)計學方法結果以±s表示，采用方差分析，如方差不齊，則采用Dunnet-t檢驗。

3 結果

3.1地塞米松對大鼠雙氯芬酸鈉肝損傷模型中肝功能和肝臟病理損傷的影響與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清ALT、AST含量明顯增高，肝細胞呈點片狀壞死，在門脈區(qū)和肝小葉內可見細胞腫脹和變性，匯管區(qū)有炎細胞浸潤，表明雙氯芬酸鈉可導致大鼠急性肝損傷。與模型對照組比較，地塞米松可明顯降低大鼠血清ALT、AST含量(P＜0.05)，減輕肝病理損傷。提示地塞米松對雙氯芬酸鈉導致的大鼠急性肝損傷有保護作用(Tab 1，F(xiàn)ig 1)。

Fig 1 Effects of dexamethasone on liver injury of rats with acute liver injury induced by diclofenac

Tab 1 Effects of dexamethasone on ALT and AST activity in rats with acute liver damage induced by diclofenac(±s，n=8)

Tab 1 Effects of dexamethasone on ALT and AST activity in rats with acute liver damage induced by diclofenac(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs Dcf

Group Dose/mg·kg-1 ALT/U·L-1 AST/U·L -1 Control - 54.13±17.09 155.75±25.70 Dcf - 173.25±65.24＊＊ 949.25±503.93＊＊Dex 10 110.25±41.74# 404.86±254.20##

3.2地塞米松對大鼠雙氯芬酸鈉肝損傷模型中肝組織MDA、GSH水平和SOD、GSH-Px活性的影響與正常對照組比較，模型對照組大鼠肝勻漿中MDA水平升高、GSH水平和SOD、GSH-Px活性明顯降低(P＜0.05)，表明雙氯芬酸鈉導致肝損傷與氧化損傷機制有關。地塞米松明顯降低大鼠肝勻漿中MDA水平、升高GSH水平和SOD、GSH-Px活性，表明地塞米松具有減少肝臟氧化損傷作用(Tab 2)。

3.3地塞米松對大鼠雙氯芬酸鈉肝損傷模型中肝臟線粒體膜電位(MMP)的影響通過測定熒光值的改變可反映線粒體膜電位的變化。正常對照組大鼠線粒體加入反應液30 s后，熒光值大幅度降低，隨后開始回升，之后基本維持穩(wěn)態(tài)。與正常對照組比較，模型對照組熒光值下降幅度較小，說明模型對照組線粒體對羅丹明123的攝取遠低于正常組，提示線粒體膜電位異常和線粒體損傷。地塞米松組線粒體對羅丹明123的攝取高于模型對照組，可明顯改善受損線粒體的功能，保持較正常的膜電位(Fig 2)。

Fig 2 Effects of dexamethasone on MMP of rats with acute liver damage induced by diclofenac

3.4地塞米松對大鼠雙氯芬酸鈉肝損傷模型中肝臟線粒體腫脹度的影響pH和高鈣均可引起線粒體腫脹度改變，線粒體腫脹時，表現(xiàn)為線粒體在一定波長的吸光度減少，可通過測定光密度值變化來反映。加入pH 7.2的反應緩沖液后，正常對照組線粒體在527 nm處的吸光度緩慢下降，提示因滲透壓異常，線粒體出現(xiàn)腫脹。模型對照組吸光度下降幅度比正常組低，提示線粒體功能受損，對環(huán)境pH值變化不敏感。地塞米松組吸光度下降幅度較模型對照組明顯增加，提示地塞米松可明顯改善受損線粒體的功能，維持對環(huán)境pH的敏感性(Fig 3A)。加入0.3 mmol·L-1的CaCl2反應緩沖液后，正常對照組線粒體吸光度明顯下降，提示線粒體出現(xiàn)明顯腫脹。

模型對照組吸光度下降幅度較低，在2 min時達到平衡。地塞米松組吸光度下降幅度明顯增加，低于正常對照組，提示地塞米松可明顯改善受損線粒體功能，維持對環(huán)境高鈣濃度的敏感性(Fig 3B)。

3.5地塞米松對大鼠雙氯芬酸鈉肝損傷模型中肝臟線粒體NADH水平和SDH、ATPase活性的影響

NADH是構成線粒體呼吸鏈的關鍵酶，增加能量代謝水平。SDH是線粒體內膜結合酶，是三羧酸循環(huán)的關鍵酶，參與細胞能量代謝，ATPase能將ATP催化水解為ADP和磷酸根釋放能量，均與線粒體功能密切相關。與正常對照組比較，模型對照組線粒體NADH水平和SDH、ATPase活性活性明顯降低(P＜0.01)，地塞米松組NADH水平和SDH、ATPase活性升高(P＜0.01)，提示地塞米松具有增強線粒體呼吸鏈酶活性的作用(Tab 3)。

Tab 2 Effects of dexamethasone on MDA，GSH，SOD and GSH-Px of rats with acute liver damage induced by diclofenac(ˉx ± s，n=8)

Fig 3A Effects of dexamethasone on mitochondrial swelling of rats with acute liver damage induced by diclofenac(pH 7.2)Fig 3B Effects of dexamethasone on mitochondrial swelling of rats with acute liver damage induced by diclofenac(CaCl2buffer)

4 討論

NSAIDs肝損傷中以雙氯芬酸鈉和舒林酸更為常見［12］，雙氯芬酸鈉發(fā)生肝損傷的幾率比其它NSAIDs高5 ～10倍［13-15］。實驗結果表明，大鼠腹腔注射雙氯芬酸鈉可導致嚴重肝損傷，表現(xiàn)為血清轉氨酶明顯升高，肝細胞呈點片狀壞死，地塞米松給藥可明顯降低雙氯芬酸鈉引起的血清轉氨酶升高，同時明顯減輕肝臟病理損傷，提示地塞米松對雙氯芬酸鈉引起的肝損傷具有明顯保護作用。

Tab 3 Effects of dexamethasone on the activities of NADH and SDH of mitochondria of rats with acute liver damage induced by diclofenac(xˉ±s，n=8)

雙氯芬酸鈉引起肝損傷的發(fā)病機制尚不清楚。研究表明，氧化應激、線粒體功能損傷、能量代謝障礙和細胞凋亡可能在雙氯芬酸鈉引起肝損傷過程中起重要作用［16-18］。氧自由基是 NSAIDs引起肝細胞功能損傷的重要原因，SOD和GSH-Px是機體內重要的抗氧化系統(tǒng)，通過抑制脂質過氧化反應，保護細胞膜結構和功能完整。實驗結果表明，地塞米松可抑制雙氯芬酸鈉引起肝臟MDA水平升高，GSH水平、SOD和GSH-Px活性降低，發(fā)揮抗氧化作用。

線粒體損傷可能是雙氯芬酸鈉肝損傷中的一個重要機制，雙氯芬酸鈉可引起線粒體腫脹、線粒體膜去極化和NADP氧化。線粒體跨膜電位是評價線粒體功能敏感指標，線粒體通透性轉換孔道開放引起的線粒體膨脹，表現(xiàn)為線粒體光密度減少［19］。因而可通過測定光密度值變化來反映線粒體的腫脹度。雙氯芬酸鈉損傷后肝臟線粒體對羅丹明123攝取量，以及對pH 7.2和高鈣引起線粒體腫脹的敏感性明顯低于正常，提示線粒體功能損傷嚴重，地塞米松可恢復線粒體羅丹明123攝取量，維持線粒體腫脹敏感性，提示受損線粒體功能明顯改善。另一方面，線粒體是細胞能量合成場所，雙氯芬酸鈉可抑制大鼠肝臟線粒體中NADH水平，SDH及ATPase活性降低，導致肝臟能量代謝紊亂。地塞米松可明顯提高線粒體NADH水平，SDH和ATPase的活性明顯增加(P＜0.01)，保護線粒體電子呼吸鏈，維持線粒體正常能量代謝作用。

綜上所述，地塞米松通過抑制氧化應激，恢復線粒體功能對雙氯芬酸鈉肝損傷具有保護作用，為NASIDs相關性肝損傷的治療提供實驗依據(jù)。

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