李偉 陳余清 孫艷 趙成嶺 王效靜

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸科，安徽省呼吸系病基礎(chǔ)與臨床省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蚌埠 233003

人肺腺癌細(xì)胞株A549中HIF-1α對(duì)survivin的表達(dá)調(diào)控

李偉 陳余清 孫艷 趙成嶺 王效靜

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸科，安徽省呼吸系病基礎(chǔ)與臨床省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蚌埠 233003

背景與目的：survivin是一種重要的抗凋亡基因，在腫瘤組織中特異性高表達(dá)，并參與調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，其高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展、藥物抵抗以及預(yù)后關(guān)系密切。但survivin在肺癌中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究甚少。課題組前期研究成功構(gòu)建含有survivin核心啟動(dòng)子的熒光報(bào)告載體pGL3-SVP230-luc，并發(fā)現(xiàn)核心啟動(dòng)子區(qū)存在缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的潛在位點(diǎn)。本研究擬通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)記法、電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)、共轉(zhuǎn)染等方法探討缺氧條件下人肺腺癌細(xì)胞株A549中HIF-1α調(diào)控survivin轉(zhuǎn)錄的確切機(jī)制。方法：⑴運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè)缺氧A549細(xì)胞中HIF-1α與survivin的表達(dá)；⑵HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒和HIF-1αsiRNA分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，30 h后RT-PCR、Western blot和免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)survivin mRNA和蛋白表達(dá)；⑶pGL3-SVP230-luc(含有survivin核心啟動(dòng)子的熒光報(bào)告載體)與HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒和HIF-1α siRNA分別共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，測(cè)定螢光素酶的表達(dá)活性；⑷EMSA分析HIF-1α與survivin核心啟動(dòng)子結(jié)合情況；(5)流式細(xì)胞術(shù)和MTT法檢測(cè)細(xì)胞凋亡和增殖。結(jié)果：⑴HIF-1α與survivin共表達(dá)于A549細(xì)胞中；⑵轉(zhuǎn)染HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒組survivinmRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA組survivin mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)；⑶HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒組pGL3-SVP230-luc相對(duì)活性分別為78.84，顯著高于空質(zhì)粒組及對(duì)照組(P＜0.01)，HIF-1αsiRNA組pGL3-SVP230-luc相對(duì)活性分別為28.84，顯著低于空質(zhì)粒組及對(duì)照組(P均＜0.01)；⑷HIF-1α與survivin核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-19～-16 bp序列結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活survivin；⑸流式細(xì)胞術(shù)和MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，HIF-1α siRNA組細(xì)胞凋亡顯著增加，細(xì)胞抑制率明顯升高，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。結(jié)論：缺氧狀態(tài)下A549細(xì)胞中survivin與HIF-1α存在共表達(dá)；HIF-1α可以通過(guò)survivin核心啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)激活survivin轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；靶向HIF-1α可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖，并為survivin的靶向治療研究提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

缺氧誘導(dǎo)因子-1α；survivin； 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)； 非小細(xì)胞肺癌

癌基因的激活和(或)抑癌基因失活導(dǎo)致細(xì)胞的增殖異常和凋亡障礙可能是肺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。survivin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)基因家族的關(guān)鍵成員，是迄今為止作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子，高表達(dá)于多數(shù)惡性腫瘤組織中［1］，其在肺癌的表達(dá)率達(dá)70.7%～96.0%［2-3］，survivin高表達(dá)與腫瘤的惡性程度、藥物抵抗以及患者預(yù)后關(guān)系密切［1］。涉及survivin在肺癌中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究甚少。缺氧是實(shí)體瘤中普遍存在現(xiàn)象，不僅會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療抵抗，而且使腫瘤細(xì)胞更具侵襲性，其中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)起關(guān)鍵作用，其在多種腫瘤中高表達(dá)［4］。轉(zhuǎn)染反義HIF-1α至胰腺癌細(xì)胞株BxPc-3后，HIF-1α和survivin的表達(dá)均下調(diào)，提示HIF-1α可能調(diào)控survivin表達(dá)［5］。Chen等［6］前期的研究證實(shí)，缺氧可誘發(fā)肺腺癌細(xì)胞株A549中survivin啟動(dòng)子活性增強(qiáng)。survivin核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-19～-16 bp和-144～-127 bp處存在HIF-1α潛在結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建-19～-16 bp堿基序列突變的螢光素酶報(bào)告基因載體pGL3-SVP229-luc，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，啟動(dòng)子活性下降36.6%。表明上述位點(diǎn)在正調(diào)控survivin表達(dá)中起重要作用。本研究將用RTPCR、共轉(zhuǎn)染等方法確證HIF-1α對(duì)survivin的表達(dá)調(diào)控作用，并結(jié)合電泳遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)結(jié)果探討HIF-1α調(diào)控survivin轉(zhuǎn)錄的確切機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人肺腺癌A549細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。pGL3-SVP-230-luc也由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存［6］。HIF-1α的真核表達(dá)質(zhì)粒由美國(guó)伊利諾斯州立大學(xué)錢(qián)峰博士后惠贈(zèng)。EMSA、螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。PCR引物、survivin探針由上海生物工程有限公司合成。r-32P［ATP］購(gòu)自北京市福瑞生物工程公司。鼠抗人HIF-1α單克隆抗體購(gòu)自SantaCruz公司，兔抗人survivin單克隆抗體、DyLightTM488標(biāo)記山羊抗鼠IgG以及DyLightTM594標(biāo)記羊抗兔IgG均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和缺氧處理

將本實(shí)驗(yàn)室保存A549細(xì)胞復(fù)蘇后并接種于含10%滅活小牛血清新鮮DMEM培養(yǎng)基液中，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，37 ℃條件下常規(guī)培養(yǎng)。A549細(xì)胞株用COCl2150 μmol/mL處理，模擬腫瘤內(nèi)部缺氧微環(huán)境，置于常規(guī)培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后收獲細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 激光共聚焦檢測(cè)A549細(xì)胞中HIF-1α和survivin蛋白的表達(dá)

雙標(biāo)免疫熒光法檢測(cè)參照Bemardini等［7］介紹的方法進(jìn)行。4%甲醛固定，PBS液反復(fù)漂洗，加入1%BSA稀釋的survivin兔抗人單抗和HIF-1α鼠抗人單抗(按1∶1混勻)，4 ℃溫育過(guò)夜；PBS充分漂洗后加DyLightTM488標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶30)、DyLightTM594(1∶40)標(biāo)記羊抗兔IgG，滴加到切片上，甘油封片。利用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察并攝像。

1.2.3 HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒和HIF-1α siRNA分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，檢測(cè)survivin表達(dá)

1.2.3.1 質(zhì)粒的制備和純化

制備JM109感受態(tài)細(xì)菌。50 μL感受態(tài)細(xì)胞懸液和1 μL pcDNA3.0-HIF-1α或者pGL3-SVP-230-luc振動(dòng)、混勻，加入1 mL無(wú)氨芐的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)液均勻涂至LB/氨芐平板上，37 ℃培養(yǎng)16 h。用Takara Minibest Plasmid Purification kit2.0說(shuō)明制備和純化質(zhì)粒。在質(zhì)粒表達(dá)載體平板劃菌后，挑取白色單克隆菌落，在含氨芐青LB液體培養(yǎng)基37 ℃過(guò)夜震蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，1%瓊脂糖電泳證實(shí)質(zhì)粒片段大小，并送少許菌液經(jīng)上海生工測(cè)序部測(cè)序鑒定。

1.2.3.2 HIF-1α siRNA的設(shè)計(jì)、合成

按本實(shí)驗(yàn)既往證實(shí)針對(duì)H I F-1 α基因(NM001530)1 521～1 541堿基的有效siRNA序列設(shè)計(jì)［6］，由上海生物工程有限公司合成。序列如下：正義鏈 5’-CUGAUGAC CAGCAACUUGAdTdT-3’， 反義 鏈5’-UCAAGUUGCUGGUCAUCAGdTdT-3’；同時(shí)合成熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照control siRNA：正義鏈5’-AGUUCAACGACCAGUAGUCdTdT-3’，反義鏈5’-GACUACUGGUCGUUGAdTdT-3’。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳轉(zhuǎn)染濃度為5O nmol/L。將熒光標(biāo)記的control siRNA和HIF-1α siRNA分別按50 nmol/L的終濃度轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后12、18和24 h用熒光顯微鏡觀(guān)察熒光陽(yáng)性細(xì)胞，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)RT-PCR檢測(cè)HIF-1α mRNA表達(dá)證實(shí)干擾效果。

1.2.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

106個(gè)A549細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞融合達(dá)到70%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；設(shè)立以下5組：pcDNA3.0-HIF-1α組、HIF-1α siRNA組、pcDNA3.0組、control siRNA組和control組(空白對(duì)照組)。轉(zhuǎn)染程序按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。工作質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒 pRL-TK按等摩爾濃度共轉(zhuǎn)染A549。質(zhì)粒的用量為每孔2 μg，內(nèi)參質(zhì)粒用量為每孔0.2 μg，siRNA轉(zhuǎn)染濃度見(jiàn)上，LipofectamineTM2000用量為每孔10 μL。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(下同)。

1.2.3.4 RT-PCR法檢測(cè)survivin mRNA表達(dá)

轉(zhuǎn)染3 0 h收集各組細(xì)胞，提取總RNA，并用M-MLA反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參照。survivin基因上游引物為5’-AGGTCATCTCGGCTGTTCCTG-3’，下游引物為5’-TCATCCTCACTGCGGCTGTC-3’；β-actin基因上游引物為5’-GAGACCTTCA ACACCCCAGCC-3’；下游引物為5’-GGCCATC TCTTGCTCGAAGTC-3’。survivin和β-actin的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度分別為147 bp和311 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min(共32個(gè)循環(huán))；72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，再經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像，用Gelworks l D Advanced v4.01軟件進(jìn)行條帶灰度分析。

1.2.3.5 Western blot檢測(cè)survivin蛋白表達(dá)

分組同上。轉(zhuǎn)染30 h收集各組細(xì)胞，裂解細(xì)胞抽提蛋白，取40 μg總蛋白行l(wèi)0%SDSPAGE分離蛋白，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入survivin鼠抗人單克隆抗體(終質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL)4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，TBST洗膜后，加1∶4 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，用Ultra ECL發(fā)光劑檢測(cè)。

1.2.3.6 激光共聚焦檢測(cè)各處理組細(xì)胞HIF-1α和survivin蛋白表達(dá)

分組同上。轉(zhuǎn)染30 h后加入survivin兔抗人單抗和HIF-1α鼠抗人單抗(按1∶1混勻)，步驟同1.2.2。

1.2.4 HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒和HIF-1 αsiRNA和報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，檢測(cè)報(bào)告基因螢光素酶活性

1.2.4.1 HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒和報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染

缺氧處理后的106個(gè)A549細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞融合達(dá)到70%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；設(shè)立以下3組：pGL3-SVP 230-luc轉(zhuǎn)染組(陰性對(duì)照組)、pGL3-SVP 230-luc與pcDNA3.0-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組、pGL3-SVP-230-luc與pcDNA3.0共轉(zhuǎn)染組。質(zhì)粒和LipofectamineTM2000用量同上。操作依照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4.2 HIF-1α siRNA和報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染

設(shè)立以下各組： HIF-1α siRNA組、control siRNA組，單獨(dú)pGL3-SVP 230-luc轉(zhuǎn)染組(陰性對(duì)照組)。siRNA濃度和轉(zhuǎn)染程序同上。siRNA轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞24 h后，pGL3-SVP 230-luc再次轉(zhuǎn)染該細(xì)胞。

1.2.4.3 螢光素酶活性分析

各組細(xì)胞在報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染30 h后采用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)螢光素酶活性，操作步驟參照Promega檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.5 EMSA實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞核蛋白抽提和濃度測(cè)定：核蛋白抽提參考文獻(xiàn)［7］的方法。用B C A法測(cè)定核蛋白濃度；雙鏈寡核苷酸探針設(shè)計(jì)如下。探針1：survivin啟動(dòng)子序列(轉(zhuǎn)錄起始區(qū)上游-26～-9 bp)，正義鏈5’-GAGGGCGTGCGCTCCCGA-3’，反義鏈5’-TCGGGAGCGCACGCCCTC-3’；探針2：s u r v i v i n啟動(dòng)子序列(轉(zhuǎn)錄起始區(qū)上游-144 bp～-127 bp)，正義鏈5’-GTCGCTGGGTGCACCGCG-3’；反義鏈5’-CGCGGTGCACCCAGCGAC-3’；突變探針1：正義鏈5’-GAGGGCAGCGCTCCCGA-3’，反義鏈5’-TCGGGAGCGCTGCCCTC-3’；突變探針2：正義鏈5’-GTCGCTGGAGCACCGCG-3’，反義鏈5’-CGCGGTGCTCCAGCGAC-3’。98 ℃加熱探針15 min，自然冷卻使其退火.用r-32P［ATP］標(biāo)記探針，G25 Sephadex柱純化探針。EMSA按Promega公司提供的試劑盒操作程序進(jìn)行。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡

設(shè)立以下5組：pcDNA3.0-HIF-1α組、HIF-1αsiRNA組、pcDNA3.0組、control siRNA組和control組。轉(zhuǎn)染48 h后胰酶消化至單細(xì)胞懸液狀態(tài)，1 500 r/min常規(guī)離心15 min(離心半徑15 cm)，PBS清洗，往100 μL細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V/FITC和10 μL 20 μg/mL的碘化丙啶溶液，混勻后于室溫避光溫育15 min。流式細(xì)胞儀通過(guò)cell Quest收集并檢測(cè)104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.2.7 MIT法觀(guān)察A549細(xì)胞增殖

分組同上。轉(zhuǎn)染48 h后，在每組的3個(gè)平行孔中加入四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，濃度為5 mg/mL)100 μL，置37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱中繼續(xù)溫育4 h，小心棄上清液，加入二甲亞砜100 μL，振蕩5 min，用Bio-Rad酶標(biāo)儀在570 nm處讀取吸光度值(D值)。細(xì)胞增殖抑制率=(1-D實(shí)驗(yàn)組平均值/D對(duì)照組平均值)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組比較進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HIF-1α和survivin蛋白在A549細(xì)胞中的表達(dá)

HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)呈綠色熒光，survivin陽(yáng)性表達(dá)呈紅色熒光，兩者在同一位置共表達(dá)呈黃色熒光。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α和survivin在A549細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核同一位置存在共表達(dá)(圖1)。

2.2 外源性轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α及其siRNA對(duì)survivin mRNA和蛋白表達(dá)的影響

HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果與Genbank公布的HIF-1α標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源性達(dá)到99.99%(圖2)。RT-PCR結(jié)果表明，與對(duì)照干擾序列相比，HIF-1α siRNA可以下調(diào)HIF-1α mRNA水平達(dá)78.3%，具有良好的干擾效果，完全能滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。pcDNA3.0-HIF-1α組和HIF-1α siRNA組survivin mRNA相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度分別為0.70±0.06和0.11±0.03，與各對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖3)。Western blot結(jié)果顯示，pcDNA3.0-HIF-1α組survivin蛋白表達(dá)強(qiáng)度為0.73±0.06，顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，HIF-1α siRNA組為0.11±0.02，顯著低于對(duì)照組(P＜0.01，圖4)。激光共聚焦檢測(cè)顯示，HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染后兩者表達(dá)的熒光強(qiáng)度明顯減弱(圖5)。

2.3 A549細(xì)胞中外源性轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α對(duì)survivin核心啟動(dòng)子活性的影響

pGL3-SVP230-luc與pcDNA3.0-HIF-1α共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞30 h后檢測(cè)螢光素酶的活性，結(jié)果顯示pcDNA3.0-HIF-1α組熒光素酶活性為78.8±6.4，顯著高于pcDNA3.0轉(zhuǎn)染組36.4±4.1和對(duì)照組32.4±2.6(P＜0.01)，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖6)。

2.4 A549細(xì)胞中HIF-1α siRNA對(duì)survivin核心啟動(dòng)子活性的影響

HIF-1αsiRNA處理組螢光素酶的活性為8.1±1.3，顯著低于control siRNA組26.1±4.1和對(duì)照組30.1±5.2(P＜0.01)，而control siRNA組熒光素酶活性與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖7)。

2.5 EMSA確認(rèn)HIF-1α與survivin核心啟動(dòng)子區(qū)-19～-16 bp位點(diǎn)的結(jié)合

樣品反應(yīng)中探針1序列(轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-26～-9 bp)與核蛋白作用，自顯影后出現(xiàn)DNA-核蛋白結(jié)合的滯后條帶；探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)中，100倍量的未標(biāo)記探針競(jìng)爭(zhēng)掉標(biāo)記探針；突變探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)則觀(guān)察到了結(jié)合條帶；為了證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所提取的核蛋白含有HIF-1α，核蛋白預(yù)先加入HIF-1α抗體處理，再加入標(biāo)記探針，Super-shift反應(yīng)中自顯影后出現(xiàn)DNA-核蛋白結(jié)合條帶及Super-shift結(jié)合條帶(圖8)。探針2序列(-144～-127 bp)與核蛋白作用，未出現(xiàn)DNA-核蛋白結(jié)合滯后條帶。表明HIF-1α僅與-26～-9 bp片段發(fā)生結(jié)合。

2.6 轉(zhuǎn)染HIF-1α及其siRNA對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

pcDNA3.0-HIF-1α組和HIF-1αsiRNA組細(xì)胞凋亡情況見(jiàn)圖9，分別為1.92±0.28和20.85±2.92，與各對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.7 轉(zhuǎn)染HIF-1α及其siRNA對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

pcDNA3.0-HIF-1α組和HIF-1αsiRNA組細(xì)胞抑制率分別為(61.3±7.6)%和(4.1±1.2)%，與各對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討 論

survivin是從人類(lèi)基因庫(kù)雜交篩選分離出的一種獨(dú)特的凋亡抑制基因，定位于染色體17q25區(qū)，全長(zhǎng)14.7 kb，由3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子組成，編碼142個(gè)氨基酸［1］，調(diào)控survivin表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在轉(zhuǎn)錄水平［8］。本課題組前期研究證實(shí)，survivin的核心啟動(dòng)子區(qū)位于-203 bp～＋64 bp處，該區(qū)域存在Sp1、E2F和p53等轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)［9］。但迄今為止，對(duì)于survivin在肺癌中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

缺氧可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞survivin啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，HIF-1α可能在此機(jī)制中發(fā)揮重要作用［10］。乏氧環(huán)境下，HIF-1α表達(dá)顯著增加，并與HIF-1β形成異二聚體，與腫瘤相關(guān)基因的缺氧反應(yīng)元件(hypoxia response element，HRE)結(jié)合，影響下游基因轉(zhuǎn)錄活性［11］。在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，survivin和HIF-1α共同高表達(dá)，并促進(jìn)了前列腺癌的侵襲和增殖，肺癌中是否存在類(lèi)似現(xiàn)象尚未見(jiàn)報(bào)道［12］。

本研究采用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)缺氧處理后A549細(xì)胞中survivin和HIF-1α的表達(dá)，結(jié)果顯示，survivin和HIF-1α在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核同一位置存在共表達(dá)，表明HIF-1α和survivin在肺癌中存在表達(dá)的相關(guān)性。我們既往曾用免疫組化法觀(guān)察120例NSCLC患者肺癌組織的survivin和HIF-1α蛋白表達(dá)水平，其表達(dá)率分別為81.60%(98/120)和58.33%(70/120)，兩者表達(dá)呈顯著正相關(guān)［13］。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，survivin mRNA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組分別上調(diào)了113%和95%，證實(shí)HIF-1α對(duì)survivin表達(dá)起正調(diào)控作用，而轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA，則顯著下調(diào)了survivin表達(dá)，從反面證實(shí)上述調(diào)控作用。這與Chang等［5］在胰腺癌中的研究結(jié)果類(lèi)似：反義HIF-1α降低了胰腺癌BxPc-3細(xì)胞的HIF-1α和survivin表達(dá)。

本研究在體外共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討了HIF-1α對(duì)survivin啟動(dòng)子活性的影響。HIF-1α表達(dá)質(zhì)粒與pGL3-SVP230-luc共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后survivin啟動(dòng)子活性顯著增高，而 HIF-1α siRNA干擾HIF-1α后，啟動(dòng)子活性下調(diào)，上述結(jié)果從正反兩方面證實(shí)了A549細(xì)胞中HIF-1α是導(dǎo)致survivin轉(zhuǎn)錄激活的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。

前期的生物信息學(xué)分析表明，survivin核心啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-19～-16 bp和-144～-127 bp處存在HIF-1α潛在結(jié)合位點(diǎn)［9］，本課題組構(gòu)建包含-19～-16 bp突變序列的螢光素酶報(bào)告基因載體，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，啟動(dòng)子活性下降36.6%，而突變-144～-127 bp關(guān)鍵序列，survivin核心啟動(dòng)子活性無(wú)顯著變化［6］。據(jù)此推測(cè)，HIF-1α可能與-19～-16 bp序列直接結(jié)合調(diào)控survivin轉(zhuǎn)錄。本研究利用EMSA技術(shù)驗(yàn)證上述推測(cè)。EMSA是一種體外證實(shí)目的蛋白與靶DNA直接結(jié)合的方法。我們提取A549細(xì)胞核蛋白，分別與經(jīng)r-32P標(biāo)記的survivin啟動(dòng)子序列-26～-9 bp和-144～-127 bp兩處HIF-1α潛在結(jié)合位點(diǎn)作用。結(jié)果表明，-26～-9 bp片段與核蛋白結(jié)合。且該復(fù)合物可以與HIF-1α特異性抗體結(jié)合。突變-19～-16 bp序列的部分堿基后，序列不能競(jìng)爭(zhēng)survivin啟動(dòng)子序列-26～-9 bp與核蛋白的結(jié)合。因此survivin核心啟動(dòng)子-19～-16 bp區(qū)是HIF-1α的結(jié)合位點(diǎn)。而-144～-127 bp序列沒(méi)有與核蛋白形成復(fù)合物條帶，提示-144～-127 bp處可能不存在HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)，這與Peng等［14］在乳腺癌細(xì)胞中的研究不完全吻合。張曉潔等［15］在研究轉(zhuǎn)錄因子Sp1對(duì)survivin轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制時(shí)亦遇到了類(lèi)似現(xiàn)象，推測(cè)造成這種差異的部分原因可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在細(xì)胞類(lèi)型特異性和刺激的依賴(lài)性有關(guān)。此外，基因的調(diào)控是由多條相互作用的信號(hào)通路構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。缺氧的A549細(xì)胞中，HIF-1α與notch1信號(hào)途徑協(xié)調(diào)調(diào)控survivin轉(zhuǎn)錄［16］。HIF-1α對(duì)survivin的調(diào)控是否還與其他上游信號(hào)通路發(fā)生交互作用，及有無(wú)HIF-1α與其余反式作用因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的可能，尚需深入探討。

本研究還發(fā)現(xiàn)，HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，不僅有效沉默靶基因survivin，而且抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示干預(yù)HIF-1α可成為治療survivin高表達(dá)肺癌的一種新手段。

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Regulation ofsurvivinexpression by hypoxia–inducible factor-1α in non-small cell lung cancer

LI Wei, CHEN Yu-qing, SUN Yan, ZHAO Cheng-ling, WANG Xiao-jing(Department of Respiratory Disease, First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Provincial Key Laboratory of Respiratory disease in Anhui, Bengbu Anhui 233004, China)

CHEN Yu-qing E-mail：bbmccyq@126.com

Background and purpose：Survivingene is a unique member of the inhibitor of apoptosis protein(IAP) family. It plays an important role, not only in regulating mitosis but also in inhibiting apoptosis. It is highly expressed in almost all types of human tumors and fetal tissues but rarely detectable in normal adult tissues. High levels ofsurvivinexpression have been associated with tumor progression, resistance to radiation and drug treatments and poor survival rates in cancer patients. The current literature contains few reports on the transcriptional regulation ofsurvivinexpression in lung cancer. Previous studies have found that there are also 2 putative binding sites for hypoxiainducible factor-1α(HIF-1α) in the core promoter region ofsurvivingene.Survivinpromoter-luciferase reporter vectors pGL3-SVP230-luc have been constructed early. The purpose of this study was to investigate the mechanism of (HIF-1α)on transcriptional regulation ofsurvivinin A549 cells by hypoxia.Methods：⑴Double labeling immunof l uorescence method was used to detect co-expression of survivin/HIF-1α protein; ⑵RT-polymerase chain reaction (RT-PCR)and Western blot was used to examine the level of survivin mRNA and protein in A549 cells transfected by HIF-1α expression plasmid and HIF-1α siRNA; ⑶Luciferase activity was detected in A549 cells following cotransfection with pGL3-SVP230-luc as well as HIF-1α expression plasmid or HIF-1α siRNA to value the transcriptional activity ofsurvivin. ⑷Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was performed to test the nuclear extract of the A549 cells binding to the r-32P labeled probes containing survivin promoter squences.Results：⑴Survivin/HIF-1α proteins coexpressed in A549 cell; ⑵Compared with control groups, the level of survivin mRNA and protein is markedly increased in A549 cells transfected with HIF-1α expression plasmid, but decreased in the HIF-1α siRNA group(P＜0.01); ⑶The relative activity of pGL3-SVP230-luc in A549 cells transfected with HIF-1α expression plasmid was 78.84, which was significantly higher than that of both the pcDNA3.0 and the negative control group in the A549 cells (P＜0.01),but was significantly lower in the HIF-1α siRNA group (P＜0.01); ⑷DNA-neucleoprotein bands were observed when A549 nuclear extracts incubating with the r-32P labeled -18 bp probe (nucleotides -26 to -9) ofsurvivincore promoter in EMSA assay. The specific bands were competed away by the cold 18 bp probe, but not the mutated cold probe in competition assay. Binding bands exhibited in Super-shift reaction. ⑸The proliferation of A549 cells was inhibited after transfection with HIF-1α siRNA. Cell apoptosis was significantly increased in HIF-1α siRNA group compared to negative control group (P＜0.01).Conclusion：The binding of HIF-1α to thesurvivincore promoter (nucleotides-19 to -16 bp in its 5’ fl anking region) increases transcription and expression of thesurvivingene. These observations have significant implications for understanding the part molecular mechanism ofsurvivintranscriptional regulation in lung cancer.

HIF-1α;survivin; Transcriptional regulation; NSCLC

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.06.002

R734.2

A

1007-3639(2011)06-0427-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No: 30772532)；安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No: 070413094)。

陳余清 E-mail:bbmccyq@126.com

2011-01-20

2011-05-15）