陳萬軍

山東省腫瘤醫(yī)院頭頸科，山東省醫(yī)學科學院，山東 濟南 250117

Cyclin G1在下咽鱗癌中的表達及其臨床意義

陳萬軍

山東省腫瘤醫(yī)院頭頸科，山東省醫(yī)學科學院，山東 濟南 250117

背景與目的：細胞周期蛋白(Cyclin G1)可能參與多種惡性腫瘤的侵襲和轉移，但鮮見Cyclin G1與下咽鱗癌關系的報道。本研究旨在探討Cyclin G1在下咽鱗癌中的表達及其與臨床生物學行為之間的關系。方法：取下咽鱗狀細胞癌手術標本56例，正常黏膜標本14例，應用免疫組化方法檢測Cyclin G1在下咽癌組織和正常黏膜中的表達；應用實時熒光定量RT-PCR檢測Cyclin G1 mRNA表達。結果：免疫組化結果顯示：Cyclin G1在下咽癌中表達主要位于細胞核，陽性率為53.6%(30/56)，而正常黏膜未見表達(P＜0.01)；隨著腫瘤的增大，其陽性表達率逐漸增高(P＞0.05)；Cyclin G1在頸部淋巴結轉移組陽性率為64.9%(24/37)，明顯高于未轉移組31.6%(6/19)(P＜0.05)；Cyclin G1陽性表達患者3年內復發(fā)率為60.0%，陰性表達患者3年內復發(fā)率 30.8%(P＜0.05)；Cyclin G1陽性表達患者5年生存率為30.0%，明顯低于陰性表達患者5年生存率57.7%(P＜0.05)。RT-PCR檢測Cyclin G1 mRNA在下咽癌組織中的相對表達量(1.081±0.302)高于正常黏膜組相對表達量(0.713±0.158)(P＜0.05)；中晚期原發(fā)腫瘤、頸淋巴結轉移及遠處轉移患者Cyclin G1 mRNA表達量均略高于早期腫瘤、無頸淋巴結及遠處轉移患者(P＞0.05)，Cyclin G1 mRNA表達量越高腫瘤越容易復發(fā)(P＜0.05)，患者生存時間也越短(P＜0.01)，與免疫組化結果一致。結論：Cyclin G1在下咽鱗癌中存在高表達，其異常表達在下咽鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，可能是下咽鱗癌預后不良的指標之一。

CyclinG1； 下咽； 鱗狀細胞； 癌

下咽鱗狀細胞癌位置隱蔽，惡性程度高，是上消化道最致命的腫瘤，其診斷、治療和預后的判斷主要依據病變部位、臨床分期及病理類型進行。然而不同患者存在個體差異，單靠這些標準往往不能得到個體化治療，且對預后估計不足。目前，下咽鱗癌的發(fā)病機制不明，從細胞周期調控異常與腫瘤的關系來看，癌癥很可能就是一類細胞周期疾?。?］。下咽癌被認為是一種多基因多步驟的復雜的細胞周期疾病，在癌變不同階段有不同的細胞周期相關蛋白發(fā)生改變，包含多個基因突變的分子事件過程［2-3］。細胞周期的調節(jié)機制決定了細胞周期蛋白在腫瘤形成和發(fā)展中的重要作用，Cyclin G1是較晚發(fā)現的一種細胞周期蛋白，本研究通過觀察下咽癌組織中Cyclin G1蛋白及基因的表達，研究其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的意義。

1 資料和方法

1.1 標本來源及治療方案

56例標本均來自我院2003年1月—2005年12月臨床病理資料保存完整的住院下咽鱗癌患者，男性54例，女性2例，年齡39～74歲，中位年齡56歲。病變位置：梨狀窩48例，下咽后壁6例，環(huán)后區(qū)2例。術前未行任何治療，均行手術切除，術后輔助放療，劑量約為60 Gy。臨床分期標準參照2002年國際抗癌學會(UICC)TNM標準，其中T12例，T29例，T320例，T425例；N019例，N115例，N220例，N32例；M055例，M11例(患側腋窩轉移，同期清掃)。

1.2 隨訪及對照設置

隨訪截止時間2010年12月，隨訪時間均在5年以上。另取下咽部正常黏膜組織14例(取自全喉切除術中最遠的正常切緣，距離腫瘤邊界3 cm以上)設為對照，所取組織經10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，經HE染色證實為正常黏膜。

1.3 主要試劑

Cyclin G1鼠抗人單克隆抗體購自福州邁新生物技術開發(fā)公司；Takara RNA PCR Kit(Amv)Ver3.0購自大連金生物有限公司，TRIzol 購自Invitrogen公司。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化實驗步驟 所有標本均經10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，其中1張HE染色，其余切片進行免疫組化染色。全部玻片采用防脫片處理，免疫組織化學技術采用SP法，并行微波抗原修復。

1.4.2 RT-PCR檢測目的基因mRNA表達的實驗步驟 ⑴總RNA提取 取約100 mg 組織，加入1 mL TRIzol試劑，以高速勻漿機制備組織勻漿，勻漿轉入1.5 mL Eppendorf 管中。4 ℃，12 000×g離心15 min，將上清液轉入另一1.5 mL Eppendorf管中，每管加入 0.2 mL氯仿，渦旋振蕩15 s混勻。室溫5 min，4 ℃，12 000×g15 min，液體分為3層，將最上層水相輕輕轉入另一1.5 mL Eeppendorf管中。每管加入0.5 mL異丙醇，顛倒混勻，室溫溫育10 min，4 ℃，12 000×g離心10min，可見管底有乳白色沉淀。棄上清液，每管加入用無RNase水配制的75%乙醇1 mL，4 ℃，7 000×g離心5 min。棄上清液，倒置離心管，室溫涼干10 min。每管加入適量的無RNase水，并使RNA充分溶解。以 Eppendorf Biophotometer RNA模式測定RNA濃度及純度，并將RNA濃度均調整為約500 μg/mL，備存用于RT-PCR反應。⑵兩步法RT-PCR 反應。①反轉錄反應 反應體系如下：MgCl24 μL，10×RT 緩沖液 2.0 μL，RNase Free H2O 8.5 μL，dNTP Mixture(各10 mmol/L)2.0 μL，RNase 抑制劑0.5 μL，AMV 反轉錄酶 1.0 μL，9 mers 隨機引物 1.0 μL，總RNA (≤1 μg) 1.0 μL，總體積20 μL。按下列程序逆轉錄：30 ℃預變性10 min，42℃變性30 min，95 ℃退火5 min，5 ℃延伸5 min。逆轉錄產物可以直接用于PCR反應，也可以-20 ℃保存?zhèn)溆谩＂赑CR反應PCR反應體系：5×PCR 緩沖液 4 μL，滅菌蒸餾水10.8 μL，Taq酶0.1 μL，目的基因上游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，目的基因下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，內參照(GAPDH)上游引物(10 μmol/L) 0.2 μL，內參照(GAPDH)下游引物(10 μmol/L) 0.2 μL，樣品的RT產物4 μL，PCR反應體系總體積為20 μL。以GAPDH為內參。兩對內參引物序列如下：GAPDH-1-正義鏈：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，GAPDH-1-反義鏈：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，GAPDH-1 的擴增長度為226 bp；GAPDH-2-正義鏈：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，GAPDH-2-反義鏈：5’-CTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’，GAPDH-2的擴增長度為554 bp。⑶引物序列 Cyclin G1-正義鏈：5’-TGG CAACTGACTTGATCCG-3’，Cyclin G1-反義鏈：5-TCTGTGCTTGGATCTCTAATGC-3’。⑷PCR反應條件 94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s、52.5 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s、35個循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。⑸瓊脂糖凝膠電泳 Alpha Innotech Imager觀察電泳條帶存入圖像，所用的DNA相對分子質量標記為DL2000。以系統軟件的Spot Density功能分別半定量分析內參照和目的基因擴增條帶的灰度，以目的基因條帶的灰度與內參照管家基因的灰度比值代表基因表達的相對水平。

1.5 免疫組化診斷標準

以細胞核中出現棕黃色顆粒為陽性，如細胞質和細胞核中同時出現棕黃色亦為陽性。以高倍鏡視野中陽性細胞占計數同類細胞的百分數作為計數點，任取10個高倍視野，計算其平均值，根據陽性細胞率進行評分，陽性細胞率＜15%為0分；陽性細胞率15%～＜25%為1分；陽性細胞率25%～＜50%為2分；陽性細胞率＞51%為3分。同時根據細胞核染色強度加以評分，細胞核無著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。根據陽性細胞率與著色強度的乘積進行最后評分，0分為陰性，≥1分為陽性。以福建邁新生物技術開發(fā)公司提供的陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.6 統計學處理

免疫組化結果采用SPSS11.0軟件包作χ2檢驗，RT-PCR結果進行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組化結果

56例組織中30例陽性表達，棕黃色顆粒主要位于細胞核(圖1)，陽性率53.6%(30/56)，其中梨狀窩25例陽性表達(52.1%，25/48)，下咽后壁區(qū)4例陽性表達(66.7%，4/6)，環(huán)后區(qū)1例陽性表達(50.0%，1/2)。T1未見陽性表達；T23例陽性表達(33.3%，3/9)；T311例陽性表達(55.0%，11/20)；T416例陽性表達(64.0%，16/25)。N06例陽性表達(31.6%，6/19)；N18例陽性表達(53.3%，8/15)；N214例陽性表達(70.0%，14/20)；N32例陽性表達(100.0%，2/2)。M029例陽性表達(52.7%，29/55)；M11例陽性表達(100.0%，1/1)。陽性表達患者3年內復發(fā)18例(60.0%，18/30)，陰性表達患者3年內復發(fā)8例(30.8%，8/26)；陽性表達患者5年生存率為30.0%(9/30)，陰性表達患者5年生存率為57.7%(15/26)。14例對照的正常黏膜均未見陽性表達(表1)。

表 1 Cyclin G1在下咽鱗中的表達Tab. 1 Expression of Cyclin G1 in hypopharyngeal squamous cell carcinoma.

2.2 RT-PCR檢測結果

Cyclin G1 的擴增長度為296 bp，內參為GAPDH-2， 擴增長度為554 bp(圖2)。結果表明, Cyclin G1 mRNA在下咽癌組織中的相對表達量(1.081±0.302)與正常黏膜組相對表達量(0.713±0.158)相比，差異有統計學意義(t=3.061，P=0.014)，說明CyclinG1 mRNA在下咽癌中的表達比正常黏膜高。中晚期原發(fā)腫瘤、頸淋巴結轉移及遠處轉移患者Cyclin G1 mRNA表達量均略高于早期腫瘤、無頸淋巴結及遠處轉移患者，但差異均無統計學意義(P＞0.05)；Cyclin G1 mRNA表達量越高腫瘤越容易復發(fā)(P＜0.05)，患者生存時間也越短(P＜0.01，表2)。

表 2 Cyclin G1 mRNA在下咽鱗癌中的含量與臨床病理參數及預后的關系Tab. 2 Relationship between Cyclin G1 mRNA expression in hypopharyngeal squamous cell carcinoma and clinicopathological features(±s)

表 2 Cyclin G1 mRNA在下咽鱗癌中的含量與臨床病理參數及預后的關系Tab. 2 Relationship between Cyclin G1 mRNA expression in hypopharyngeal squamous cell carcinoma and clinicopathological features(±s)

Clinical pathologic data Cases Cyclin G1mRNA tP Cancer and normal 3.061 0.014 Cancer 56 1.081±0.302 Normal adjacent epithelium 14 0.713±0.158 Primary tumor 1.246 0.218 T1-2 11 1.010±0.354 T3-4 45 1.131±0.273 Lymph node metastasis 1.534 0.131 N0 19 1.025±0.298 N+ 37 1.149±0.282 Distant metastasis 0.043 0.967 M0 55 1.107±0.294 M1 1 1.120 3-year recurrence 2.459 0.017 Yes 26 1.206±0.259 No 30 1.022±0.294 Survival time/year 3.418 0.001＜5 32 1.213±0.304≥5 24 0.967±0.206

3 討 論

Cyclin G是新發(fā)現的與傳統周期蛋白不同的周期蛋白家族，包括3個亞型：Cyclin G1、Cyclin G2和Cyclin G3，它們在細胞周期調節(jié)、生長抑制、細胞凋亡和分化方面有特殊作用。Cyclin G1發(fā)現最早，其啟動子內包括2個p53的結合位點，其因各種DNA損傷因子引起的表達上調與p53的激活相符。因此，Cyclin G1基因的表達與p53腫瘤抑制基因有著密切的關系，Cyclin G1已被證實是p53的一個下游基因，能被p53 誘導表達，在DNA損傷的修復和腫瘤發(fā)生中有重要作用。Cyclin G1通過PP2A調節(jié)MDM2的去磷酸化水平和部位進而調節(jié)p53而達到調節(jié)細胞生長的作用［4］。然而，Cyclin G1又經常在缺少p53的細胞和組織里被發(fā)現，故也可能通過獨立于p53的途徑被調節(jié)。Cyclin G1在胃腺癌組織中的陽性表達率為62.96%，其表達與腫瘤的分化程度相關，與腫瘤的浸潤深度及有無淋巴結轉移無關，Cyclin G1陽性表達在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，并可能以不依賴p53的途徑發(fā)揮作用［5］。Cyclin G1蛋白主要定位于細胞核，在細胞周期各時相表達水平基本一致，較為穩(wěn)定［6］。在結腸癌中，Cyclin G1的表達遠高于正常組織，D期患者高于AB期患者，提示腫瘤侵襲的程度和范圍可能與Cyclin G1的表達有關，但淋巴結轉移與Cyclin G1的表達無顯著相關［7］。Cyclin G1蛋白在卵巢漿液性囊腺癌中表達增高，可能與卵巢漿液性囊腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。研究表明Cyclin G1可能與細胞周期G2/M檢查點的調控有關，在卵巢癌化療中，Cyclin G1過表達的細胞對順鉑、多柔比星等藥物的細胞毒性更加敏感，可用于卵巢癌化療藥物篩選［8］。最近的研究表明，Cyclin G1過表達可提高新生心肌細胞DNA合成，但抑制胞質分裂，導致雙倍體、多倍體數目增加，Cyclin G1缺乏可延緩因負荷過大引起的多核心肌細胞的增加［9］。

總之，Cyclin G1在下咽鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中有重要意義，Cyclin G1高表達及其mRNA高水平可能是下咽鱗癌預后不良的指標之一［10］。對于Cyclin G1高表達及其mRNA高水平患者，應加強綜合治療，密切隨訪。

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The clinical significance of Cyclin G1 in hypopharyngeal carcinoma

CHEN Wan-jun(Department of Head and Neck Surgery,Shandong Cancer Hospital,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan Shandong 250117, China)

CHEN Wan-jun E-mail：wjchen2003@yahoo.com.cn

Background and purpose：Cyclin G1 may be involved in the progression of invasion and metastasis of many malignant tumors, but there have been few reports about the relationship between Cyclin G1 and hypopharyngeal carcinoma. This study aimed to determine the relationship between Cyclin G1 and the biological behavior of hypopharyngeal squamous cell carcinoma.Methods：Immunohistochemistry and real time quantitative polymerase chain reaction methods were applied to determine Cyclin G1 expression and gene amplification in 56 cases of hypopharyngeal squamous cell carcinoma and 14 cases of normal adjacent epithelium. The results were compared with clinical variables and patient outcomes.Results：Positive expressions of Cyclin G1 in the tumorous cell were observed in 30 cases (53.6%), whereas no expression of Cyclin G1 was found in normal epithelium(P＜0.01).Cyclin G1 overexpression increased gradually from T1 to T4, but no significant difference was found(P＞0.05). Cyclin G1 immunoreactivity in cases with lymph node metastases was significantly higher than those without lymph node metastases(P＜0.05). The recurrence rates in the patients with positive expression of Cyclin G1 were 60.0%, significantly higher than the patients with negative expression(P＜0.05). On the other hand, the 5-year overall survival rates for the patients with positive expression were 30.0%, significantly lower than that with negative expression(P＜0.05).The average Cyclin G1 mRNA level in patients with hypopharyngeal carcinoma were much higher than those in normal epithelium(P＜0.05). No significant difference of Cyclin G1 mRNA expression in primary tumor, lymph node metastasis and distant metastasis were found in hypopharyngeal carcinoma(P＞0.05). Cyclin G1 mRNA expression were significantly related with recurrence and survival time(P＜0.05).Conclusion：Cyclin G1 is highly expressed in hypopharyngeal squamous cell carcinoma. It may play a role in the progression of hypopharyngeal squamous cell carcinoma and can predict the probable course and outcome of the disease.

Cyclin G1; Hypopharynx; Squamous cell; Carcinoma

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.02.008

R739.8；R730.23

A

1007-3639(2011)02-0120-05

山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金項目(No：2008BS03034)。

陳萬軍 E-mail:wjchen2003@yahoo.com.cn

2010-11-22

2011-01-10）