康燕燕 唐莉莉 石磊 陳海龍 林南靜 馬興元

華東理工大學生物工程學院應(yīng)用生物學系，上海 200237

重組蛋白TATm-Survivin(T34/117A)對乳腺癌細胞周期變化與凋亡的影響

康燕燕 唐莉莉 石磊 陳海龍 林南靜 馬興元

華東理工大學生物工程學院應(yīng)用生物學系，上海 200237

背景與目的：Survivin是一個抗凋亡、促增殖的雙功能基因，且高表達于多種惡性腫瘤和轉(zhuǎn)化組織中，使其成為抗腫瘤藥物研究的新靶點。本研究觀察經(jīng)點突變的重組蛋白藥物TATm-Survivin(T34/117A)處理乳腺癌細胞B-Cap-37后，對乳腺癌細胞B-Cap-37細胞周期和增殖的影響，檢測其對癌細胞促凋亡且抑制增殖的藥效并初步探討其分子機制。方法：重疊PCR法在TATm-Survivin(T34A)基因上引入突變位點Thr117→Ala117，MTT法檢測細胞增殖；流式細胞術(shù)分析細胞凋亡和細胞周期及線粒體膜電位變化；Western blot檢測Aurora B激酶底物Histone H3的磷酸化水平和Caspase-3激活情況。結(jié)果：TATm-Survivin(T34/117A)蛋白對B-Cap-37細胞的增殖有顯著的抑制作用；作用24 h后，細胞被阻滯在G0/G1期，G0/G1期細胞由對照組的(54.1±6.1)%顯著增加到(62.7±5.1)%(P＜0.05)，作用48 h后，細胞被阻滯在G2/M期，G2/M細胞由對照組的(16.6±8.9)%顯著增加到(24.0±6.0)%；Aurora B激酶活性通過Histone H3的磷酸化水平間接反映，蛋白藥物處理48 h后p-Histone H3的灰度值由對照組的100%降低到89.8%(P＜0.05)；48 h時，細胞線粒體膜電位由對照組的(649.9±8.0)%顯著降低到(582.9±15.6)%(P＜0.05)；細胞凋亡率由對照組的(4.6±0.7)%顯著增加到(42.7±0.5)%(P＜0.01)，與對照相比，不同濃度的重組蛋白均激活了Caspase-3。結(jié)論：重組蛋白TATm-Survivin(T34/117A)對乳腺癌B-Cap-37具有抑制增殖、促凋亡作用，其與降低Aurora B激酶的活性，并激活Caspase-3相關(guān)。

TATm-Survivin(T34/117A)； 點突變； 乳腺癌； 周期阻滯； 凋亡

Survivin是哺乳動物細胞中凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族最小的成員，高表達于原發(fā)性乳腺癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤細胞中，但在正常細胞和組織中卻很少能檢測到［1-2］。Survivin又是染色體乘客蛋白(chromosomal passenger complex，CPC)的成員，參與細胞周期調(diào)控，是一個有絲分裂調(diào)控子。Survivin作為一個獨特的雙功能蛋白且擁有在腫瘤組織中選擇性表達的特性，已成為腫瘤治療的新靶點，以此為靶點的抗癌藥物研究已成為國內(nèi)外研究的熱點。

目前，以Survivin為靶點的抗癌藥物設(shè)計多以基因治療為主，主要是抑制Survivin抗凋亡并促癌細胞生存的功能，包括Survivin反義寡核苷酸、siRNA、反義RNA及負顯性突變等。Tu等［3］構(gòu)建的病毒介導的Survivin突變體能導致癌細胞凋亡、周期分裂失調(diào)，并抑制血管生成和腫瘤生長。但在蛋白水平，因為Survivin既不是激酶也不是細胞表面蛋白，所以用小分子或抗體作用該靶點有困難。Ma等［4］獲得了由突變型HIV-TAT跨膜肽介導的，以Survivin為藥靶的促癌細胞凋亡的重組蛋白藥物HIV-TAT-m-Survivin(T34A)。

本研究根據(jù)Survivin獨特的生物功能，在本實驗室HIV-TAT-m-Survivin(T34A)的研究基礎(chǔ)上［4］，將與細胞增殖調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵活性位點117位氨基酸進行正確突變，以阻止Aurora B激酶對該位點的磷酸化，構(gòu)建表達載體pRSET-TATm-Survivin(T34/117A)，在大腸埃希菌表達純化后，以乳腺癌細胞B-Cap-37為受檢細胞，檢測重組蛋白對乳腺癌細胞周期變化與凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞和質(zhì)粒

B-Cap-37細胞購買于上海腫瘤特殊項目檢測中心。受體菌DH5α和BL2I(DE3)由本實驗室保存。pRSET-B-TATm-Survivin(T34A)為本實驗室已構(gòu)建質(zhì)粒［4］。

1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、IPTG、DL-2000 DNA Marker等購自日本Takara公司，陽離子交換介質(zhì)SP Sepharose FF購自美國Amersham pharmacia公司，噻唑蘭(MTT)、碘化丙啶(PI)、羅丹明123購自美國Sigma公司，Annexin V assay Kit購自美國Clontech公司，β-actin、Survivin、Actived-Caspase-3、p-Histone H3.1(S10)抗體購自美國BioVision公司；化學發(fā)光試劑盒LumiGlo購自美國Cell Signaling公司。

緩沖液A：包涵體洗滌液，2 mol/L Urea，20 mmol/L PB緩沖液，pH=6.5；緩沖液B：平衡緩沖液，20 mmol/L PB緩沖液，pH=6.5；緩沖液C：上柱平衡液，8 mol/L Urea，20 mmol/L PB緩沖液，pH=6.5；緩沖液D：蛋白洗脫液，20 mmol/L PB緩沖液，0.5 mol/L NaOH，pH=6.5。

1.3 基因定點突變

以pRSET-B-TATm-Survivin(T34A)為基礎(chǔ)質(zhì)粒，依據(jù)《精編分子克隆實驗指南》中以引物重疊-延伸為基礎(chǔ)的重疊PCR法［5］,利用3步PCR在Thr117位引入突變位點Ala117(Thr117→Ala117)，構(gòu)建為質(zhì)粒pRSET-B-TATm-Survivin(T34/117A)，酶切鑒定并測序。突變體亞克隆引物：Psur1：5’-ATATGGATCCATGGGTGCCCCGACGTT-3’(BamHⅠ)，Psur2：5’-GTTCTCGAGTCAATCCATGGCAGCC-3’(XhoⅠ)，突變點引入引物Pm1：5’-AATTGCAAAGGAAGCCAACAATAAGAAGAAAG-3’，Pm2：5’-CTTTCTTCTTATT GTTGGCTTCCTTTGCAATT-3’。

1.4 TATm-Survivin(T34/117A)誘導表達、純化及復性

將轉(zhuǎn)化有BL21(DE3)/pRSET-B-TATm-Survivin(T34/117A)的大腸埃希菌過夜培養(yǎng)后按2%接種于LB/Ampicilin(100 μg/mL)培養(yǎng)基中，37 ℃搖瓶發(fā)酵，至A600達0.8左右，加入終濃度為0.75 mmol/L的IPTG誘導表達，培養(yǎng)5 h后500×g離心20 min收菌。

4℃冰浴條件下超聲破碎菌體，8 000×g離心后所得包涵體用緩沖液B進行4次洗滌，緩沖液C溶解，8 000×g4℃離心20 min后，上清液即為含有變性蛋白的上柱樣品。將上述樣品過SP Sepharose FF陽離子交換柱進行交換吸附。交換柱依次由緩沖液B、C平衡10～15個柱體積，上樣20 μg/mL(總蛋白/柱床體積)。100%～0%緩沖液C梯度柱上復性，流速1 mL/min，至無蛋白流出。緩沖液D洗脫目標蛋白，流速3 mL/min。收集目標峰，透析除鹽，超濾濃縮，Bradford法測定濃度。

1.5 SDS-PAGE，Western blot及毛細管電泳

將待檢蛋白樣品同標準分子量蛋白一起進行15%SDS-PAGE電泳［6］。電泳上樣時在電泳膠上左右對稱上樣，中間加標準相對分子質(zhì)量蛋白，電泳結(jié)束后把膠從中間分割開，左一半膠用考馬斯亮藍R-250染色，右一半膠用于Western blot轉(zhuǎn)印。將轉(zhuǎn)印好的PVDF膜置于含封閉緩沖液(5%脫脂牛奶溶于TPBS)的玻璃大平皿中，室溫漂洗2 h，然后棄去封閉液，加入兔抗人Survivin多克隆抗體(一抗，用TPBS稀釋800倍)，室溫下漂洗1 h，再用TPBS緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次漂洗10 min，加入山羊抗兔抗體(二抗，用PBST稀釋5 000倍)。室溫漂洗1 h，用PBST漂洗2次，每次10 min，最后用紅外掃膜儀掃描拍照，利用Smart(Bio-Rad)軟件分析目的蛋白的表達情況與純化復性后的純度。

胰酶消化并收集細胞，6孔板中每孔細胞加入200μL裂解液，漩渦振蕩器裂解細胞。水煮沸細胞裂解液10 min后，-20 ℃保存。采用Bradford方法測定蛋白濃度［6］。行常規(guī)Western blot，最后掃描獲取灰度值，以目的蛋白與β-actin灰度值之比作為蛋白的相對表達量。

用含50%乙腈的25 mmol/L PB緩沖液(pH：3.1)平衡毛細管(總長度/有效長度25/15 cm)2 min，將純化后蛋白樣品以0.5 mg/mL濃度進樣［6］。

1.6 MTT檢測

乳腺癌B-Cap-37細胞在DMEM培養(yǎng)基(含10%小牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)、CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃飽和濕度的條件下培養(yǎng)。對數(shù)生長期的B-Cap-37細胞胰酶消化后接種于96孔板，每孔1×104個細胞。待細胞50%～60%匯聚時，加入TATm-Survivin(T34/117A)重組蛋白(終濃度依次為0、70.0、91.0、118.3、153.8、199.9 μg/mL)，另設(shè)調(diào)零孔和只加相同緩沖液的對照孔，每個處理6個復孔。培養(yǎng)24、48、72 h后加入MTT液(5 mg/mL)20 μL，37 ℃溫育4 h后棄上清液，加入DMSO 150 μL/孔，測定A495值。以藥物濃度為橫坐標軸，通過計算重組蛋白作用后的細胞存活率來反映細胞的增殖情況，并計算藥物對細胞作用48 h后的半抑制濃度(IC50)。

1.7 流式細胞術(shù)

參考《實用流式細胞術(shù)彩色圖譜》中的方法［7］，用胰酶(0.25%)消化并收集經(jīng)TATm-Survivin(T34/117A)蛋白藥物處理24、48 h的細胞，預(yù)冷PBS洗1次后加入3倍體積預(yù)冷的70%乙醇固定，-20℃保存過夜。檢測前用預(yù)冷PBS洗滌細胞1次，調(diào)整細胞懸液密度為5×105/mL，取100 μL細胞懸液加入400 μL含有50 μg/mL PI、50 μg/mL RNase A的PBS溶液。37 ℃避光處理30 min，流式細胞儀分析細胞周期。

收集經(jīng)TATm-Survivin(T34/117A)蛋白藥物處理48 h并消化的細胞，以終濃度為10 μg/mL的羅丹明123(Rho123)處理細胞，37 ℃避光處理30 min，150×g離心5 min去上清液，預(yù)冷PBS洗2次后，0.5 mL PBS重懸，立即用流式細胞儀分析線粒體膜電位變化［7-8］。

收集經(jīng)TATm-Survivin(T34/117A)蛋白藥物處理48 h并消化的細胞，按AnnexinV- FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書處理細胞，1 h內(nèi)流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.8 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)均用表示，多組樣本間均值比較采用單因素方差分析，如果差異顯著，進行多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Survivin基因定點突變

用特異性引物對Psur1與Pm2、Psur2與Pm1，以pRSET-B-TATm-Survivin(T34A)為模板，PCR擴增出2條約340 bp(圖1A)和90 bp(圖1B)條帶，與預(yù)期大小相符，回收目的條帶。再以Psur1與Psur2引物對，以340和90 bp片段混合物互為模板進行PCR擴增，連接2個片段，所得全序列為429 bp (圖1C)，突變位點為Thr117→Ala117，質(zhì)粒構(gòu)建后經(jīng)酶切鑒定及測序結(jié)果均正確(圖2、3)。

2.2 TATm-Survivin(T34/117A)的誘導表達與純化復性

小批量搖瓶發(fā)酵，37 ℃、0.75 mmol/L IPTG誘導5 h后收集菌體，經(jīng)SDS-PAGE和Smart(Bio.rad)軟件分析目的蛋白的表達量，最高可達菌體總蛋白的35%。目的蛋白經(jīng)過4次洗滌并行陽離子柱交換后純度達98%，透析除鹽并超濾濃縮，最終可獲得終濃度為2 mg/mL的經(jīng)復性處理的重組蛋白。

樣品經(jīng)SDS-PAGE及毛細管電泳，發(fā)現(xiàn)純化復性后的蛋白樣品中含2種相對分子質(zhì)量不同的蛋白(圖4A)，經(jīng)Western blot證實2條帶均為Survivin蛋白(圖4B)。根據(jù)毛細管電泳原理斷定，20.1×103附近的條帶為TATm-Survivin(T34/117A)單體，43×103附近的條帶為TATm-Survivin(T34/117A)二聚體形式(圖4C)。

2.3 TATm-Survivin(T34/117A)對細胞增殖的影響

不同濃度TATm-Survivin(T34/117A)作用24、48和72 h后，B-Cap-37細胞存活率呈現(xiàn)時間和濃度依賴性下降。藥物濃度為153.8 μg/mL，在48 h時，TATm-Survivin(T34A)對細胞抑制率為25.45%，TATm-Survivin(T34/117A)對細胞抑制率為33.5%；在72 h時, 兩種蛋白對B-Cap-37細胞的抑制率分別為33.4%和45.8% (圖5)。藥物作用48 h的IC50為(180.5±5.3) μg/mL。

2.4 TATm-Survivin(T34/117A)對細胞周期變化的影響

表1所示，當?shù)鞍姿幬餄舛确謩e為0、60、90、150、180 μg/mL時，作用24 h后，TATm-Survivin(T34/117A)使乳腺癌細胞B-Cap-37阻滯在G0/G1期，且這種阻滯具有劑量依賴性。與對照(0 μg/mL)相比，隨藥物濃度的增加，G0/G1期細胞所占的比例由(54.1±6.1)% 顯著增加到(62.7±5.1)%(P＜0.05)，S期細胞所占比例由(28.4±0.1)%顯著降低到(15.8±0.8)%(P＜0.05)，而G2/M期細胞比例無顯著性變化。作用48 h后，細胞被阻滯在G2/M期，G2/M細胞所占比例由(16.6±8.9)%顯著增加到(24.0±6.0)%，G0/G1期細胞所占比例由(59.8±4.7)% 下降到了(50.2±5.1)%，與對照相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，S期細胞所占比例仍呈降低趨勢，但與對照相比差異無統(tǒng)計學意義。

表 1 PI單染檢測TATm-Survivin(T34/117A)(μg/ml)對乳腺癌細胞B-Cap-37周期的影響Tab. 1 Flow cytometric data showing the effect of TATm-Survivin (T34/117A) protein on cell cycle to B-Cap-37

Histone H3是Aurora B激酶的磷酸化底物，可通過檢測Histone H3磷酸化程度間接反映Aurora B激酶的活性［9］。如圖6A所示，不同濃度的重組蛋白作用B-Cap-37細胞24和48 h后，與對照相比，其Ser10位磷酸化的Histone H3灰度值顯著降低(P＜0.05) (圖6B)，表明Aurora B激酶活性有顯著降低，且48 h相比24 h，Histone H3磷酸化程度更低，但不同的蛋白藥物濃度之間對Aurora B激酶活性的影響差異無統(tǒng)計學意義。

2.5 TATm-Survivin(T34/117A)對細胞凋亡的影響

隨蛋白藥物濃度的增加，羅丹明123的熒光曲線逐漸左移，表明其強度逐漸降低，與0 μg/mL相比，當?shù)鞍诐舛葹?00 μg/mL時，線粒體膜電位由(649.9±7.8)% 顯著降低到(582.9±15.6)%(圖7)。說明TATm-Survivin(T34/117A)影響了B-Cap-37細胞的線粒體膜電位。

不同濃度TATm-Survivin(T34/117A)蛋白藥物作用細胞48 h后，流式細胞術(shù)分析細胞凋亡見圖8A，濃度0、100、200、300 μg/mL所對應(yīng)的凋亡率分別為(4.6±0.7)%、(10.8±0.6)%、(23.9±0.8)%(P＜0.05)和(42.7±0.5)%(P＜0.01)(圖8B)，蛋白藥物對細胞凋亡率影響呈濃度依賴性。

TATm-Survivin(T34/117A)重組蛋白激活了Caspase-3，且與對照(0 μg/mL)相比，不同濃度的重組蛋白作用B-Cap-37細胞24和48 h后，被激活的Caspase-3表達量均明顯增強，但不同濃度的藥物之間差異無統(tǒng)計學意義(圖9)。

3 討 論

本研究設(shè)計了含雙負顯性突變位點并連接有具高效跨膜結(jié)構(gòu)域HIV-TATm的Survivin突變體，阻滯了Survivin在34位和117位的磷酸化，將其在大腸埃希菌中表達后，通過柱上復性和離子交換分離獲得了高純度的重組蛋白藥物TATm-Survivin(T34/117A)，它可使乳腺癌細胞B-Cap-37阻滯在G0/G1期和G2/M期，從而抑制乳腺癌細胞B-Cap-37的增殖；重組蛋白同時降低線粒體膜電位，通過激活Caspase-3誘導細胞凋亡。本研究獲得了一種新的以Survivin為靶標的重組蛋白藥物，體外研究結(jié)果顯示，其有候選抗乳腺癌藥物的應(yīng)用前景。

Survivin作為CPC成員之一，既是CPC核心成員Aurora B激酶的磷酸化底物［10］，也是Aurora B的正調(diào)控分子，可反饋性提高Aurora B的活性［11］。有研究證實，Aurora B激酶可在第10位絲氨酸磷酸化Histone H3，磷酸化的Histone H3(S10)不僅與染色體濃縮和染色體分離有關(guān)，而且涉及激活近著絲粒異染色質(zhì)［12-13］。在爪蟾和哺乳動物細胞中都發(fā)現(xiàn)干擾Survivin后，Histone H3磷酸化水平降低［14-15］。本研究將Survivin Thr117位突變?yōu)锳la117后，抑制了Aurora B激酶對Survivin117位的磷酸化，使細胞阻滯在G0/G1期和G2/M期，抑制了細胞增殖。

細胞凋亡在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有重要作用，而癌細胞的重要標志是逃脫細胞凋亡而無限增殖。Survivin是抗凋亡家族成員中最特殊、抗凋亡功能最強的新成員。目前的研究表明，Survivin可能通過線粒體路徑實現(xiàn)抗凋亡功能，通過直接或間接抑制凋亡終末效應(yīng)分子Caspase-3、 Caspase-7，最終抑制細胞凋亡［16-17］。在轉(zhuǎn)基因動物實驗上顯示，Survivin定位于線粒體上，并且與上游的Caspase-9和凋亡刺激因子(SMACE/DIABLO)相互作用，最后影響終端效應(yīng)子Caspase-3、Caspase-7的活性，使細胞發(fā)生凋亡。Mesri等［18］采用編碼Survivin(Thr34Ala)突變體的復制缺陷性腺病毒載體阻止了p34cdc2-cyclin B1對Survivin的磷酸化，激發(fā)了細胞線粒體凋亡途徑并抑制了荷瘤小鼠腫瘤的生長。本研究中Survivin Thr34突變?yōu)锳la34后線粒體膜電位顯著下降，并激活了凋亡執(zhí)行因子Caspase-3，最終誘導了細胞凋亡。

通過Thr117突變獲得的重組蛋白TATm-Survivin(T34/117A)抑制了Aurora B激酶活性，導致細胞周期發(fā)生阻滯，抑制了細胞增殖，并通過Caspase-3途徑誘導乳腺癌細胞B-Cap-37凋亡。研究結(jié)果提示，TATm-Survivin(T34/117A)降低了線粒體膜電位，誘導了細胞凋亡，其是否引發(fā)細胞色素C的釋放，激活了細胞線粒體凋亡途徑，有待進一步的研究。

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Effects of recombinant protein TATm-Survivin(T34/117A) on cell cycle and apoptosis of B-Cap-37 cell

KANG Yan-yan,TANG Li-li,SHI Lei,CHEN Hai-long,LIN Nan-jing,MA Xing-yuan(Department of Applied Biology, School of Biotechnology of East China University of Science and Technology, Shanghai 200237,China)

MA Xing-yuan E-mail：maxy@ecust.edu.cn

Background and purpose：Survivin is a bifunctional gene in both antiapoptosis and proproliferation and is also highly expressed in many malignant tumors and transformed cells. This makes it an attractive target for anti-cancer drug development. This study investigated the effects of the recombinant protein TATm-Survivin(T34/117A) on cell cycles and the apoptosis of breast cancer cell B-Cap-37, as well as explored the overall molecular mechanism.Methods：Thr117 was replaced by Ala117 on TATm-Survivin (T34A) by overlapping PCR. The B-Cap-37 cells were treated by purified TATm-Survivin (T34/117A). The MTT method was used to observe the cell proliferation process. Flow cytometry assay was used to analyze the cell cycle, apoptosis and mitochondrial membrane potential.Western blot was used to determine the phosphorylation level of Histone H3, a substrate of Aurora B kinase, as well as the expression of activated Caspase-3.Results：TATm-Survivin (T34/117A) significantly inhibited the proliferation of B-Cap-37 cells. After 24 hours of treatment, the cells arrested in the G0/G1phase(62.7±5.1)% as compared with the control group (54.1±6.1)%(P＜0.05). After 48 hours, the cells significantly arrested in the G2/M phase (24.0±6.0)% as compared with the control group (16.6±8.9)%(P＜0.05). Compared with the control group, the gray intensity in the phosphorylation levels of Histone H3 in the treated cells was significantly down to 89.8% (P＜0.05). Apoptosis rates increased significantly, from (4.6±0.7) % in the control to (42.7±0.5)%(P＜0.01). Meanwhile, mitochondrial membrane potential significantly decreased from (649.9±7.8) % in the control to (582.9±15.6) % (P＜0.05) while Caspase-3 was activated.Conclusion：TATm-Survivin (T34/117A) inhibits proliferation and promotes apoptosis of B-Cap-37 cells by reducing the activity of Aurora B kinase while activating Caspase-3.

Recombinant TATm-Survivin(T34/117A); Point mutant; Breast cancer; Cell cycle arrest;Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.02.003

R737.9

A

1007-3639(2011)02-0091-08

國家自然科學基金資助項目(No:C0304)。

馬興元 E-mail:maxy@ecust.edu.cn

2010-12-06

2011-01-27）