康麗軍 洪峰 馮建兵 劉威 吳華 易俊莉 王甦民

(1.北京老年醫(yī)院 北京 100095;2.北京結(jié)核病控制研究所 北京 100035;3.北京洛奇臨床檢驗所 北京 102206)

結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸快速檢測方法臨床應(yīng)用價值

康麗軍1洪峰2馮建兵3劉威1吳華1易俊莉2王甦民2

(1.北京老年醫(yī)院 北京 100095;2.北京結(jié)核病控制研究所 北京 100035;3.北京洛奇臨床檢驗所 北京 102206)

目的評價結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸快速檢測方法的臨床應(yīng)用價值>。方法應(yīng)用實時熒光PCR技術(shù)對420例標(biāo)本進行臨床試驗研究,并與抗酸桿菌涂片和分枝桿菌培養(yǎng)方法對照比較>。結(jié)果結(jié)核分枝桿菌核酸檢測靈敏度為48.5%(其中菌陽標(biāo)本靈敏度為95.8%,菌陰標(biāo)本靈敏度為14.5%),特異度99.3%,陽性預(yù)測值為99.1%,陰性預(yù)測值為55.5%;臨床試驗388例痰標(biāo)本中檢測出1例非結(jié)核分枝桿菌核酸陽性,經(jīng)測序確認(rèn),準(zhǔn)確率100%;同時對32例非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進行核酸檢測,并經(jīng)測序確認(rèn),準(zhǔn)確率100%>。結(jié)論應(yīng)用實時熒光PCR技術(shù),能實現(xiàn)在1支管內(nèi)同時進行結(jié)核分枝桿菌/非結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測。該方法具有簡單快速、特異性好污染性少的特點?？勺鳛閷嶒炇逸o助檢測結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸方法之一。

分枝桿菌,結(jié)核;分枝桿菌屬;核酸類;聚合酶鏈反應(yīng)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群引起的疾病;而非結(jié)核分枝桿菌則引起NTM病。由于結(jié)核病和NTM病兩者在發(fā)病、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、涂片和培養(yǎng)、結(jié)核菌素試驗、病理學(xué)檢查等方面均十分相似,臨床上很難進行區(qū)分診斷,只能從標(biāo)本中分離出分枝桿菌,作菌種鑒定,才能確診。而菌種鑒定往往需要1～2個月的時間,由于兩種病的治療方案不同,這樣會延誤對病人的診斷和治療,同時也造成不必要的經(jīng)濟損失。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的引進,一些快速、簡單準(zhǔn)確的方法已應(yīng)用于實驗室,如常用的HPLC是通過分析分枝桿菌細胞壁的特異性成分結(jié)核菌脂酸(mycolic acid)和β-羥基-α脂肪酸的不同鑒定分枝桿菌,核酸的直接測序方法等國內(nèi)外都有相關(guān)報道,并使分枝桿菌感染流行病方面長期存在的問題迎刃而解,但未見在1支管內(nèi)同時能夠檢測結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸的方法。我們采用實時熒光PCR[1-3]技術(shù)對本院收集的臨床標(biāo)本,在每1支管內(nèi)同時檢測結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸,并對其應(yīng)用價值進行評價。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 收集2009—2010年臨床標(biāo)本420例(包括32株P(guān)NB陽性臨床分離株)。肺結(jié)核組：按中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會《肺結(jié)核診斷和治療指南》規(guī)定[4]收集臨床已確診的結(jié)核病人痰標(biāo)本235例,其中痰菌陽性樣本97例,痰菌陰性病例138例。非結(jié)核肺部疾患病人痰標(biāo)本103例(支氣管肺炎51例,肺癌病人29例,肺膿瘍7例,細菌性肺炎9例,間質(zhì)性肺炎7例)。健康志愿者咽拭子標(biāo)本50例。男性263例,女性157例,平均年齡52.9歲(最大96歲,最小14歲)。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床分離株來源 結(jié)核分枝桿菌H37Rv,迪氏分枝桿菌,南非分枝桿菌,鳥分枝桿菌,胞內(nèi)分枝桿菌,蟾蜍分枝桿菌,土地分枝桿菌,堪薩斯分枝桿菌,不產(chǎn)色分枝桿菌,施氏分枝桿菌,偶然分枝桿菌,愛知分枝桿菌,杜氏分枝桿菌,加地斯分枝桿菌,利英斯分枝桿菌,奧布分枝桿菌,副偶然分枝桿菌,羅德島分枝桿菌,瘰疬分枝桿菌,恥垢分枝桿菌,海分枝桿菌,龜分枝桿菌,龜分枝桿菌膿腫亞種,草分枝桿菌各一株均來自于中國藥品檢定所。32株對硝基苯甲酸培養(yǎng)基(PNB)陽性非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株收集于本院與北京結(jié)核病控制研究所。

1.1.3 儀器 ABI 7700熒光PCR分析儀

1.1.4 試劑 博奧生物有限公司研究開發(fā)的結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)用于臨床標(biāo)本結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測。批號：20080201

1.2 方法

1.2.1 痰、咽拭子抗酸桿菌染色涂片、培養(yǎng)及分枝桿菌菌種鑒定對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗：均嚴(yán)格按《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》操作。

1.2.2 實時熒光PCR方法 采用博奧生物有限公司研究開發(fā)的結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒,對臨床采集標(biāo)本進行抗酸、提取及PCR擴增。

1.2.2.1 核酸提取[5]按照參考文獻[5]方法進行,并略做修改。簡述如下：痰液及咽拭子中加入等量的4%NaOH溶液,震蕩混勻。取1 ml液化后標(biāo)本充分渦旋后12 000轉(zhuǎn)/min離心5 min,棄上清。加入1 ml洗液,充分渦旋后 12 000轉(zhuǎn)/min離心5 min,棄上清。加入50 μ l核酸提取液,充分渦旋轉(zhuǎn)入核酸提取管中,放入核酸提取儀,最大轉(zhuǎn)速振蕩5 min。95℃水浴鍋中放置5 min,瞬時離心,放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 PCR擴增 取出擴增反應(yīng)液,置于冰盒上,解凍,每個標(biāo)本取核酸 2 μ l(吸取核酸盡量吸取上層液體),加入擴增反應(yīng)液管中。然后進行PCR擴增：37℃300 s 1個循環(huán);94℃180 s 1個循環(huán);94℃15 s 40個循環(huán);60℃30 s 40個循環(huán);50℃10 s 1個循環(huán)。在檢測時,同時選擇FAM和HEX(或VIC)通道,采集熒光點選擇在60℃30 s。每次檢測均設(shè)陰性和陽性對照。陰、陽對照品加入量均為 2 μ l。

1.2.3 結(jié)果的分析判定 確定陽性和陰性對照品是否擴增正常。

正常陰性對照品：無S型擴增曲線,且Ct應(yīng)為40或無任何數(shù)值。

正常陽性對照品：擴增呈S型曲線,且Ct應(yīng)小于40。

以上2個條件應(yīng)同時滿足,否則,此次實驗視為無效。

樣品擴增呈S型曲線,且Ct值小于40的報告陽性,否則為陰性。

結(jié)果解釋見表1。

1.2.4 DNA序列測定 對檢測為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)的樣品核酸進行DNA序列測定,以驗證熒光PCR檢測結(jié)果。對擴增得到的PCR產(chǎn)物通過標(biāo)準(zhǔn)的Sanger DNA測序方法進行直接DNA序列測定(北京邁奧德恩生物科技有限公司)。

表1 結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸(PCR-熒光探針法)檢測結(jié)果解釋

表2 M TB/N TM 細菌學(xué)(表型)與核酸檢測結(jié)果(實時熒光PCR方法)

表 3 NTM 細菌學(xué)(表型)與核酸檢測結(jié)果(實時熒光 PCR方法)

2 結(jié)果

2.1 本次試驗共收集臨床標(biāo)本420例。以細菌學(xué)結(jié)果為對照,應(yīng)用PCR-熒光探針法檢測388例痰、咽拭子和32例臨床分離株標(biāo)本中結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸。結(jié)核分枝桿菌核酸靈敏度為48.5%(其中菌陽標(biāo)本靈敏度為95.9%,菌陰標(biāo)本靈敏度為14.5%)特異性99.3%(其他肺部疾患和健康組共153例,核酸陽性1例)。陽性預(yù)測值為99%,陰性預(yù)測值為55.4%。在388例PNB陰性痰和咽拭子標(biāo)本中;377例為NTM核酸陰性,特異性99.7%。1例NTM核酸陽性,敏感度100%。同時對32份PNB陽性臨床分離株和23份(只做對照不統(tǒng)計在表內(nèi))非結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進行核酸檢測,55份標(biāo)本NTM均為陽性。敏感度為100%,并經(jīng)測序加以確認(rèn),檢測結(jié)果請見表2、3。

2.2 重復(fù)性 選取本次試驗標(biāo)本中46例,再次進行結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測。符合率100.0%。

3 討論

多年來,由于中國結(jié)核病的控制項目的實施和所取得的經(jīng)驗,進一步完善了現(xiàn)代結(jié)核病控制的策略和方法,但由于 HIV/AIDS的流行逐漸增加,NTM病的發(fā)病率迅速上升,美國研究表明HIV陽性者是感染NTM病的高危人群[6]。NTM病主要損害肺部,具有與結(jié)核病臨床表現(xiàn)相似的全身中毒癥狀和局部損害表現(xiàn),在無菌種鑒定結(jié)果的情況下,可能誤診為結(jié)核病,多數(shù)NTM對抗結(jié)核藥物耐藥。用抗結(jié)核藥物治療療效不佳,并且藥物會對患者的肝及神經(jīng)系統(tǒng)有所損害,由于NTM病人和M TB病人在治療上存在著差異。所以確定NTM感染病人在臨床上有重要意義。傳統(tǒng)方法鑒別MTB和NTM方法主要以細菌學(xué)為主,傳統(tǒng)的PNB培養(yǎng)法是依據(jù)PNB在一定的濃度[7](含PNB500 mg/ml培基)下選擇抑制結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的生長而不抑制非結(jié)核分枝桿菌生長原理,作為實驗室常規(guī)檢測項目,該方法由于周期長操作繁瑣,不能及時為臨床醫(yī)生提供診斷依據(jù),有其局限性。本研究采用博奧公司開發(fā)生產(chǎn)的《結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌熒光PCR試劑盒》對420例臨床標(biāo)本進行了核酸檢測,該方法利用結(jié)核分枝桿菌和分枝桿菌特異性的核酸序列,采用雙重實時熒光PCR技術(shù)和TaqMan探針技術(shù)實現(xiàn)對分枝桿菌的檢測。分別針對結(jié)核分枝桿菌和分枝桿菌的特異性序列設(shè)計引物和探針,2個探針分別標(biāo)記不同的熒光物質(zhì)。當(dāng)反應(yīng)體系中有目的基因存在時,隨著PCR反應(yīng)的進行,就會釋放出熒光。通過檢測不同通道的熒光信號,來檢測結(jié)果,從而實現(xiàn)在一管中同時檢測結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌。

臨床上診斷菌陰肺結(jié)核是長期存在的難點。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會《肺結(jié)核診斷和治療指南》中菌陰肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn),其中之一是指經(jīng)痰涂片法和/或培養(yǎng)法進行分枝桿菌檢查為陰性的活動性肺結(jié)核。對于結(jié)核病人標(biāo)本,其結(jié)核分枝桿菌的檢出結(jié)果受多種因素限制：包括病理狀況,例如結(jié)核病變性質(zhì)、病變嚴(yán)重程度、病變是封閉或開放的、病變排出的菌量及排出的間歇時間;結(jié)核分枝桿菌狀態(tài),例如代謝及繁殖是否旺盛、是否處于休眠狀態(tài),細菌形態(tài)多樣性等因素。菌陰肺結(jié)核占全部肺結(jié)核的40%～60%。菌陰肺結(jié)核病人如果不給予治療,近一半的病人將發(fā)展為涂陽,成為新的傳染源[8]。本研究的熒光PCR方法是檢測樣本中的分枝桿菌核酸,如果病變處排菌量少或處于排菌間歇時間,則無法檢測到樣本中的分枝桿菌核酸。本方法的菌陰結(jié)核靈敏度(14.5%)低于其他作者報道的熒光PCR的靈敏度(約40%)[9],分析原因是本次試驗選取的菌陰標(biāo)本大多是臨床診斷為穩(wěn)定期的病人,痰標(biāo)本連續(xù)三次以上取樣均為涂陰培陰結(jié)果。在痰菌陰性標(biāo)本中,可能標(biāo)本量少的原因,PNB為陰性檢出1例NTM陽性,經(jīng)追蹤檢查為外地來京治療非結(jié)核分枝桿菌感染病人。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院誤診誤治了一段時間。所以對于菌陰結(jié)核的檢測,需聯(lián)合其他方法和臨床診斷結(jié)果來確定。

長期以來,由于非結(jié)核分枝桿菌受到檢查和鑒定菌種方法等因素的限制,分枝桿菌屬的分類鑒定一直采用以表型特征為主的方法,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析,PCR-核酸雜交以及直接核酸測序技術(shù)為分枝桿菌的分類、鑒定開辟了新途徑。本實驗應(yīng)用雙重實時熒光PCR和 TaqMan探針技術(shù),通過420例臨床標(biāo)本的分枝桿菌核酸檢測,可以實現(xiàn)幾個小時,在1支管內(nèi)同時完成MTB/NTM分枝桿菌核酸檢測。該方法特異性好,污染性少,為臨床實驗室分枝桿菌常規(guī)檢測、流行病學(xué)NTM調(diào)查及分布狀況提供一個快速準(zhǔn)確的輔助檢測方法。

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Clinical value of real-time FQ-PCR assay for detection of Mycobacterium tuberculosis/non-tuberculous mycobacteria

Kang Lijun,Hong Feng,Feng Jianbing,Liu Wei,Wu Hua,Y i Junli,Yi Junli,Wang Sumin
1.Beijing Old Hospital,Beijing100095,China;
2.Beijing Research Institute for Tuberculosis Control,Beijing100035,China;
3.Beijing Lawke HeaHh laboratory,Beijing102206,China

ObjectiveTo evaluate the clinical diagnostic value of real-time FQ-PCR assay for the detection ofMycobacterium tuberculosis(MTB)/non-tuberculous mycobacteria(NTM).Methods420 specimens were detected by real-time FQ-PCR,and the results were compared with those of AFB smear and culture.ResultsThe sensitivity of FQ-PCR was 48.5%,in which the sensitivity in bacterium-positive and bacterium-negative specimens were 95.8%and 14.5%,respectively.The specificity,positive predictive value and negative predictive value of FQ-PCR were 99.3%,99.1%and 55.5%,respectively.1 of 388 sputum specimens was NTM-positive by FQ-PCR,which was confirmed by DNA sequencing.32 NTM isolates were confirmed by FQ-PCR and DNA sequencing.Their accuracy was 100%.ConclusionsThe real-time FQ-PCR was a simple,rapid and specific assay for the detection ofMycobacterium tuberculosis/non-tuberculous mycobacteria in a sealed tube.

Mycobacterium tuberculosis;mycobacterum;nucleic acids;polymerase chain reaction

Hong Feng(hongfeng@bjhb.gov.cn)

洪峰(hongfeng@bjhb.gov.cn)

2011-03-05)

(本文編輯：張曉進)