何建 陳冬云 魏嬌

(湖北省宜昌市第三人民醫(yī)院 宜昌 443003)

噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)尿液結(jié)核分枝桿菌對(duì)腎結(jié)核的診斷價(jià)值探討

何建 陳冬云 魏嬌

(湖北省宜昌市第三人民醫(yī)院 宜昌 443003)

目的利用噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)尿液結(jié)核分枝桿菌,評(píng)價(jià)其對(duì)腎結(jié)核診斷價(jià)值。方法對(duì)腎結(jié)核患者63例應(yīng)用涂片抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、噬菌體生物擴(kuò)增法進(jìn)行尿液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè),聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)結(jié)核菌DNA。同時(shí)選正常人群21人作為對(duì)照組行尿液噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌,聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA>。結(jié)果腎結(jié)核患者尿液行噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌陽性率明顯高于涂片抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)(P＜0.01)。與PCR法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)尿液中結(jié)核分枝桿菌對(duì)腎結(jié)核診斷有較高的特異度(95.2%)和靈敏度(69.8%)>。結(jié)論噬菌體生物擴(kuò)增方法檢測(cè)尿液結(jié)核分枝桿菌對(duì)腎結(jié)核診斷具有重要的參考價(jià)值。

結(jié)核,腎/尿;分枝桿菌,結(jié)核;細(xì)菌噬菌體

腎結(jié)核常需通過臨床表現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)室檢查,影像學(xué)檢查等相結(jié)合來進(jìn)行診斷。但由于腎結(jié)核早期癥狀輕微及不典型病例的增加,易造成診斷延誤或漏診。如何提高腎結(jié)核的診斷率并縮短確診時(shí)間是結(jié)核病防治工作中需面對(duì)的問題。我們通過對(duì)63例腎結(jié)核患者采用噬菌體生物擴(kuò)增法(phage amplified biologically assay,PhaB)檢測(cè)尿液液中的結(jié)核分枝桿菌,來評(píng)價(jià)其對(duì)腎結(jié)核的診斷價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 按入院先后順序選擇2006年1月—2010年2月確診的腎結(jié)核住院患者63例,其中男37例,女26例,年齡25～67歲,平均 36歲。結(jié)核部位：左腎22例,右腎 29例,雙腎12例。合并輸尿管結(jié)核19例,膀胱結(jié)核5例。泌尿生殖系統(tǒng)外結(jié)核6例,其中肺結(jié)核 4例,腰椎結(jié)核1例,胸壁結(jié)核1例。本組患者中有尿路刺激癥狀 44例(69.8%),血尿 21例(33.3%),腰痛 48例(76.2%),發(fā)熱 7例(11.1%),僅有輕微腰痛、無顯著膀胱刺激癥狀等不典型表現(xiàn)8例(12.7%)。63例患者行靜脈腎盂造影(IVP)檢查有異常者58例,占92.1%,診斷為腎結(jié)核22例,占34.9%。行IVP檢查診斷腎結(jié)核的22例中提示腎盞破壞,邊緣不整如蟲蝕10例,空洞破壞腎盂并與腎盂融合5例,腎皮質(zhì)一致性變薄3例,分離性、不均衡性腎積液4例。IVP檢查示輸尿管異常19例,其中輸尿管邊緣不整 6例,積液擴(kuò)張 8例,僵硬變細(xì) 2例,呈“串珠狀”改變3例。行IVP檢查異常但定性困難的其他36例中表現(xiàn)為腎盂腎盞稍微變形14例,腎小盞杯口稍模糊8例,小空洞形成3例,腎積液(不排除泌尿系結(jié)石)4例,腎皮質(zhì)局部變薄2例,患腎不顯影5例。63例患者行B超檢查25例診斷為腎結(jié)核,此25例中腎實(shí)質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)邊緣不清的低回聲區(qū)7例,腎實(shí)質(zhì)內(nèi)有邊緣不規(guī)則的無回聲區(qū),內(nèi)部有點(diǎn)狀與絮狀回聲區(qū)者5例,腎盞腎盂內(nèi)呈無回聲區(qū)的積液圖像8例,腎臟縮小,腎實(shí)質(zhì)與腎盂腎盞界限不清5例。35例行膀胱鏡檢查,鏡下膀胱黏膜慢性水腫充血32例,占91%(32/35),其中膀胱內(nèi)壁結(jié)節(jié)3例,膀胱內(nèi)壁潰瘍5例。未見明顯異常3例,占8.6%(3/35)。8例行膀胱內(nèi)壁結(jié)節(jié)或潰瘍處肉芽組織取活組織進(jìn)行病理檢查診斷為膀胱結(jié)核5例,慢性炎癥3例。25例行患側(cè)輸尿管逆行插管,發(fā)現(xiàn)輸尿管完全梗阻8例,占32%(8/25)。所有腎結(jié)核患者除影像學(xué)檢查有結(jié)核病的表現(xiàn)或可疑表現(xiàn)外,均符合以下2項(xiàng)中任何一項(xiàng)：(1)尿結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)或(和)尿沉渣涂片抗酸染色陽性;(2)病理檢查證實(shí)有結(jié)核病變;并結(jié)合臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室各種檢查結(jié)果作出診斷。同時(shí)選在我院體檢的正常人群21作為對(duì)照組,行尿液噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核桿菌及聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)結(jié)核菌DNA。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床觀察指標(biāo) 63例腎結(jié)核患者入院后即留取24 h尿沉渣做涂片抗酸染色法檢查結(jié)核分枝桿菌3次、行尿液噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng),聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA。

1.2.2 檢測(cè)方法

1.2.2.1 PhaB法 按照結(jié)核分枝桿菌噬菌體法檢測(cè)試劑盒(進(jìn)口藥品注冊(cè)證：S20060045,生產(chǎn)批號(hào)：I-9-21,生產(chǎn)企業(yè)：BIOTEC Laboratories Ltd)說明書配制所需試劑。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。操作如下：(1)尿液標(biāo)本前處理。每份尿液標(biāo)本加1倍體積4%NaOH液化,放置約15 min,4000轉(zhuǎn)/min離心15 min,去上清,沉淀物中加入1 ml完全培養(yǎng)基混勻,轉(zhuǎn)移至無菌反應(yīng)管中備用。(2)噬菌體侵染。取噬菌體0.1ml加入反應(yīng)管中充分混勻,37℃孵育1 h。(3)終止侵染。加入0.1 ml殺毒劑,充分混勻,室溫放置5 min后加入5 ml培養(yǎng)液和1 ml指示細(xì)胞。(4)澆注平皿與培養(yǎng)。上述混合培養(yǎng)液與5 ml溶解瓊脂液混勻后倒入無菌平皿中,旋轉(zhuǎn)混勻,待凝固成型,置于37℃培養(yǎng)18～24 h,每次檢測(cè)要同時(shí)設(shè)定陽性對(duì)照和陰性對(duì)照平皿。結(jié)果判定：≥20個(gè)菌斑為陽性。

1.2.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA。采用結(jié)核分枝桿菌核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字S20063112,生產(chǎn)企業(yè)：成都永安制藥有限公司),嚴(yán)格按照試劑盒廠家提供的使用說明和操作步驟完成相應(yīng)檢測(cè)并判斷結(jié)果。

1.2.2.3 尿液結(jié)核桿菌涂片觀察 治療前留取24 h尿液濃縮涂片抗酸染色檢查結(jié)核桿菌3次。具體操作按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[1]進(jìn)行。采用的顯微鏡為OLYMPUS COVER-015型。

1.2.2.4 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)觀察 治療前行尿液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng),培養(yǎng)用改良羅氏培養(yǎng)基。培養(yǎng)8周未見生長(zhǎng)即報(bào)陰性結(jié)果。對(duì)培養(yǎng)陽性者經(jīng)對(duì)硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基及噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基進(jìn)行菌種鑒定證實(shí)為結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以SPSS10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。率比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 四種檢測(cè)方法的陽性率比較 見表1。

表1 4種檢測(cè)方法的陽性率陰性率比較

采用噬菌體生物擴(kuò)增法陽性率與涂片抗酸染色法陽性率比較χ2=21.46 P＜0.001,采用噬菌體生物擴(kuò)增法陽性率與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率比較χ2=16.81 P＜0.01,采用噬菌體生物擴(kuò)增法陽性率與聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)結(jié)核菌DNA陽性率比較χ2=0.64 P ＞0.05。

2.2 PhaB法及聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA兩種方法特異度、敏感度比較 見表2。

正常人群21人行尿液噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌1例檢測(cè)陽性,聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)結(jié)核菌DNA 3例檢測(cè)陽性。

表2 2種測(cè)定結(jié)果的特異度、敏感度及95%可信區(qū)間(%)

3 討論

腎結(jié)核的典型臨床特征為逐漸加重的尿頻、尿痛和血尿3大癥狀。近年臨床表現(xiàn)不典型者增多。我們總結(jié)本院收治的63例腎結(jié)核患者中,有8例患者不存在上述3大癥狀的不典型病例。這些不典型病例給腎結(jié)核的診斷帶來了困難,造成了誤診,因而延誤了最佳藥物治療時(shí)期。

在腎結(jié)核的影像學(xué)診斷中X線檢查中IVP是最常用的檢查方法。63例腎結(jié)核患者IVP檢查發(fā)現(xiàn)有異常的占 90%以上,診斷為腎結(jié)核只占34.9%,主要原因如下：(1)在腎結(jié)核早期,病變局限在腎乳頭,IVP檢查常常無特殊表現(xiàn);只有在腎實(shí)質(zhì)明顯破壞時(shí)才出現(xiàn)改變;(2)當(dāng)患腎廣泛破壞時(shí),患腎不顯影,IVP上不能顯示典型的結(jié)核性破壞病變;(3)一些不典型表現(xiàn)如小空洞常難于與腎囊腫相鑒別;(4)腸內(nèi)容物較多時(shí)也會(huì)影響病灶的觀察,有時(shí)也受人為和客觀因素的影響;(5)IVP只能通過腎盂、輸尿管及膀胱顯影評(píng)價(jià),一些異常表現(xiàn)常難與慢性腎盂腎炎、腎乳頭壞死、黃色肉芽腫性腎盂腎炎等疾病相鑒別。

理論上尿液濃縮作涂片抗酸染色法檢查結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及病理學(xué)診斷是診斷腎結(jié)核金標(biāo)準(zhǔn)。我院35例患者行膀胱鏡檢查僅5例行膀胱病檢確診結(jié)核病變而輔助診斷腎結(jié)核,陽性率不高,且為侵入性檢查,臨床使用受限。文獻(xiàn)報(bào)道尿沉渣涂片作抗酸染色找抗酸桿菌陽性率一般為50%～70%;尿液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率可高達(dá)45%～80%。本組研究中尿液涂片法找到結(jié)核分枝桿菌18例(28.6%),結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性僅21例(33.3%),低于文獻(xiàn)報(bào)道。分析其可能的原因如下：(1)尿液中含結(jié)核分枝桿菌數(shù)量較少,(2)患側(cè)輸尿管的閉塞或狹窄,輸尿管堵塞閉鎖、腎自截等影響結(jié)核分枝桿菌的排出。(3)腎結(jié)核的結(jié)核分枝桿菌常間隙性排出,使尿檢結(jié)核分枝桿菌陰性。(4)可能與實(shí)驗(yàn)室條件及操作等原因有關(guān)。

自PCR法用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌以來,我國(guó)陸續(xù)有類似報(bào)道采用該法檢測(cè)尿液中的結(jié)核分枝桿菌。其陽性率明顯高于尿結(jié)核菌抗酸染色檢查及尿結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。國(guó)外報(bào)道其陽性率達(dá)94.3%[2]。我們的資料顯示尿PCR-TB陽性率為76.2%(48例),與采用噬菌體生物擴(kuò)增法陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但由于臨床標(biāo)本擴(kuò)增和培養(yǎng)標(biāo)本體積的巨大差異,易于污染,實(shí)驗(yàn)室條件及操作等原因,可出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果。本院結(jié)果顯示假陰率23.8%(15例),假陽性率14.3%(3例)。需要指出的是目前的結(jié)核分枝桿菌PCR檢測(cè)商業(yè)試劑盒,由于基本上都僅針對(duì)1個(gè)(或幾個(gè))結(jié)核分枝桿菌特異性基因靶序列進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè),只能夠作為輔助參考,不能作為結(jié)核病診斷的主要指標(biāo),因此不能單獨(dú)作為臨床診斷腎結(jié)核的標(biāo)準(zhǔn),必須同時(shí)參照結(jié)核分枝桿菌的傳統(tǒng)微生物學(xué)檢查的結(jié)果并參考其他臨床檢查手段所得到的結(jié)果進(jìn)行綜合判斷[3]。

噬菌體生物擴(kuò)增方法是近年來建立的一種細(xì)菌學(xué)快速診斷新技術(shù),其原理是：當(dāng)臨床標(biāo)本中含有活的結(jié)核分枝桿菌時(shí),噬菌體就可侵入菌體內(nèi)進(jìn)行大量繁殖,最終裂解菌體,釋放出來的噬菌體可感染指示細(xì)胞,使指示細(xì)胞裂解,在瓊脂上出現(xiàn)噬菌斑。此方法用于快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌已有很多文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]。胡忠義等[6]用其檢測(cè)痰標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌,在200～500條/ml時(shí)即可檢出,而傳統(tǒng)的涂片和培養(yǎng)檢測(cè)MTB靈敏度為1×103～1×104條/ml。

鑒于PhaB法的優(yōu)點(diǎn),我們用該法檢測(cè)尿液中的結(jié)核分枝桿菌,陽性率與涂片抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。該法特異度達(dá)到95.2%,靈敏度達(dá)到69.8%。雖靈敏度低于PCR法,但由于特異度略高于PCR-TB,而且可以在18～24 h內(nèi)觀察結(jié)果,因此可以快速、可靠地檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌,對(duì)早診斷、早治療具有重要的參考價(jià)值。

相比較于PCR法,該法的最大優(yōu)點(diǎn)是一旦結(jié)果陽性可以診斷為活菌生長(zhǎng),而PCR法無論死還是活的結(jié)核分枝桿菌仍可以得出陽性結(jié)果,因此PhaB法對(duì)臨床治療可以提供治療有效參考。在對(duì)照組正常人群中有1例噬菌體檢測(cè)陽性,但從臨床癥狀、尿常規(guī)、泌尿系B超檢查均未發(fā)現(xiàn)有泌尿系結(jié)核依據(jù)。考慮原因如下：(1)噬菌體生物擴(kuò)增方法實(shí)際操作影響因素較多,如反應(yīng)時(shí)間、溫度、噬菌體活性、殺病毒劑濃度等;(2)與少數(shù)幾種非結(jié)核分枝桿菌有交叉反應(yīng),如恥垢分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥胞內(nèi)分枝桿菌等也可出現(xiàn)陽性反應(yīng);(3)不排除病理性腎結(jié)核可能,因腎臟微小病灶自行愈合常規(guī)檢測(cè)不能查出。對(duì)該檢測(cè)陽性者進(jìn)行隨訪觀察,1年后行噬菌體生物擴(kuò)增方法檢測(cè)尿液結(jié)核分枝桿菌為陰性,尿常規(guī)、泌尿系B超復(fù)查無異常。因此考慮為實(shí)驗(yàn)室誤差可能性大。從實(shí)驗(yàn)過程來說為了避免誤差,我們的體會(huì)是應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：(1)留取標(biāo)本前受檢者應(yīng)盡量清洗尿道外口部防止污染;(2)操作中可對(duì)尿液標(biāo)本進(jìn)行前處理,消化結(jié)核分枝桿菌周圍物質(zhì),使結(jié)核分枝桿菌充分暴露,噬菌體容易接觸并進(jìn)入結(jié)核分枝桿菌通過前處理而得到更為真實(shí)可靠的結(jié)果。

另外按科研設(shè)計(jì)要求,對(duì)照組還應(yīng)設(shè)立非結(jié)核分枝桿菌泌尿系感染者、泌尿系非感染性疾病者,因文中研究時(shí)間內(nèi)無符合數(shù)目的相應(yīng)病例,故未設(shè)其他對(duì)照組,是本文存在的不足。

以上綜合結(jié)果表明,采用PhaB法檢測(cè)腎結(jié)核患者尿液標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌具有較高的敏感性和特異性,同時(shí)簡(jiǎn)便、快速;全程只需要48h,加上本法檢測(cè)的是活菌,因此可為腎結(jié)核的診斷提供有力依據(jù),這對(duì)早期診斷,從而積極治療具有重要參考價(jià)值。

[1]中國(guó)防癆協(xié)會(huì).結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程[J].中國(guó)防癆雜志,1996,18(1)：28-30.

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The diagnostic value for renal tuberculosis by detection of Mycobacterium tuberculosis from Urine with phage amplified biologically assay

He Jian,Chen Dongyun,Wei Jiao
Department of Tuberculosis Disease,The third people's Hospital of Y ichang,Y ichang443003,China

ObjectiveTo evaluate the diagnostic value for renal tuberculosis by detection ofMycobacterium tuberculosisfrom Urine with phage amplified biologically(phaB)assay.Methods63 patients with renal tuberculosis and 21 healthy subjects were recruited as research group and control,respectively.We detectedMycobacterium tuberculosisin the urine from research group patient using smear,culture and phaB.Meanwhile TB-DNA were detected from the urine by polymerase chain reaction(PCR).The urine from the control were detected using phaB and PCR.ResultsThe positive rate of detection forMycobacterium tuberculosisfrom urine by phaB in research group was significant higher than that by smear and culture(P＜0.01).But the positive rate was no significant difference between using phaB and using PCR(P＞0.05),Specificity and sensitivity of phaB for detectingMycobacterium tuberculosisfrom urine was 95.2%and 69.8%,respectively.ConclusionPhaB is useful tool to detectMycobacterium tuberculosisfrom urine for diagnosis of renal tuberculosis.

tuberculosis,renal/urine;Mycobacterium tuberculosis;bacteriophages

He Jian(hejian0914@sina.com)

何建(hejian0914@sina.com)

2010-11-21)

(本文編輯：范永德)