張?zhí)K陽(yáng)， 陳佳正， 李曉英， 韓泳平

(西南民族大學(xué)少數(shù)民族藥物研究所，四川成都 610041)

八味秦皮丸由秦皮、針鐵礦、草莓、多刺綠絨蒿、寒水石(制)、美麗風(fēng)毛菊、朱砂、麝香等組成，為藏藥常用處方，具有接骨、消炎、止痛的功效，用于骨折、骨髓炎［1］。其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有理化和薄層鑒別，缺乏指標(biāo)性成分的定量測(cè)定，難以有效地綜合評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量。秦皮為本方中主藥，現(xiàn)代研究證明，秦皮中的主要有效成分秦皮甲素和秦皮乙素［2-4］具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用［5］。麝香對(duì)非特異性炎癥亦具有顯著抗炎效果［6-8］。本實(shí)驗(yàn)以方中主藥秦皮中的秦皮甲素和秦皮乙素以及麝香中的麝香酮為指標(biāo)成分，分別建立基于HPLC和GC的定量測(cè)定法，以控制制劑質(zhì)量，取得了較為滿意的結(jié)果。

1 儀器與試藥

Waters 2695型高效液相色譜儀，2996 PDA檢測(cè)器;Agilent 7890A氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID);METTLER TOLEDO AE240電子分析天平［梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司］;KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

八味秦皮丸(自制，0.25 g每丸)，秦皮甲素對(duì)照品(購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所 批號(hào)0740-200104，供定量測(cè)定用)，秦皮乙素對(duì)照品(購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所 批號(hào)110741-200506，供定量測(cè)定用)，麝香酮對(duì)照品(購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所 批號(hào)110719-200511，供定量測(cè)定用)。甲醇和乙醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

HPLC條件:色譜柱為依利特C18柱(4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸溶液(27∶73);體積流量1.0 mL/min;柱溫 室溫;檢測(cè)波長(zhǎng)344.4 nm。

GC條件:采用HP-5毛細(xì)管柱(5%-二苯基聚硅氧烷共聚物色譜柱)30 m ×0.25 mm ×0.25 μm;載氣為氮?dú)?99.99%);檢測(cè)器溫度為250℃;進(jìn)樣口溫度為220℃;分流比為40∶1;程序升溫150℃開(kāi)始以10℃/min速度升溫至170℃保持4 min，然后以15℃/min速度升溫至230℃保持5 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取秦皮甲素對(duì)照品10.01 mg、秦皮乙素對(duì)照品10.02 mg，置50 mL量瓶中，分別加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取秦皮甲素5 mL、秦皮乙素3 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得秦皮甲素和秦皮乙素的混合對(duì)照品溶液［9］(含秦皮甲素0.100 1 mg/mL，秦皮乙素60.1 μg/mL)。精密稱取麝香酮對(duì)照品15.20 mg置于100 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得麝香酮對(duì)照品溶液(0.152 0 mg/mL)。

2.2.2 樣品溶液的制備 精密稱取本品1.25 g，置50 mL蒸餾瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，水浴上加熱回流0.5 h，放冷，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為HPLC測(cè)定樣品溶液。精密稱取本品5.04 g，加入無(wú)水乙醇15 mL，密塞，振搖，放置1h，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為GC測(cè)定樣品溶液。

圖1 HPLC色譜圖A.秦皮甲素和秦皮乙素混合對(duì)照品 B.樣品 C.缺秦皮陰性樣品 1.秦皮甲素 2.秦皮乙素Fig.1 HPLC chromatogramsA.reference substances of aesculin and aesculetin B.sample C.negative sample without Fraxini Cortex 1.aesculin 2.aesuletin

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺秦皮陰性樣品1.25 g，按照HPLC測(cè)定樣品溶液的制備方法制備缺秦皮的陰性溶液。取缺麝香陰性樣品5.23 g，按照GC測(cè)定樣品溶液的制備方法制備缺麝香的陰性溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

按2.2項(xiàng)下操作，分別取秦皮甲素和秦皮乙素混合對(duì)照品溶液、樣品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果在與對(duì)照品峰保留時(shí)間一致的位置上，樣品溶液的秦皮甲素和秦皮乙素峰峰形良好，理論板數(shù)按秦皮乙素計(jì)算不低于5 000，秦皮甲素和秦皮乙素與相鄰峰的分離度均大于1.5，陰性對(duì)照無(wú)干擾峰。色譜圖見(jiàn)圖1。

按2.2項(xiàng)下操作，分別取麝香酮對(duì)照品溶液、樣品溶液及陰性對(duì)照溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，按色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果在與對(duì)照品峰保留時(shí)間一致的位置上，樣品溶液的麝香酮峰峰形良好，理論板數(shù)以麝香酮峰計(jì)不低于3 000，與相鄰組分能夠達(dá)到完全分離，陰性對(duì)照無(wú)干擾峰。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 GC色譜圖A.麝香酮對(duì)照品 B.樣品 C.缺麝香酮陰性樣品 1.麝香酮Fig.2 GC chromatogramsA.reference substance of muscone B.sample C.negative sample without moschus 1.muscone

2.4 線性關(guān)系考察

按2.2.1項(xiàng)下操作，精密量取秦皮甲素和秦皮乙素的混合對(duì)照品溶液 2、4、6、8、15、25 μL 注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

按2.2.1項(xiàng)下操作，精密量取麝香酮對(duì)照品溶液1、2、4、6、10 mL 分別置于 10 mL 量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別取1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。

分別以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣體積為橫坐標(biāo)，將峰面積與進(jìn)樣體積進(jìn)行線性回歸，得各組分的回歸方程，見(jiàn)表1。結(jié)果表明該方法在較大范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 線性關(guān)系考察Tab.1 Linear correlation

2.5 精密度試驗(yàn)

按2.2.1項(xiàng)下操作，精密量取秦皮甲素和秦皮乙素混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得秦皮甲素峰面積的RSD為0.80%，秦皮乙素峰面積的RSD為0.47%。結(jié)果表明精密度良好。

按2.2.1項(xiàng)下操作，精密量取麝香酮對(duì)照品溶液1 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得麝香酮峰面積的RSD為0.68%。結(jié)果表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，精密稱取5份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別在高效液相色譜儀上進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果秦皮甲素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.399 3 mg/g，RSD 為0.86%;秦皮乙素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.972 1 mg/g，RSD為1.21%，表明重現(xiàn)性良好。

取同一批樣品，精密稱取5份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別在氣相色譜儀上進(jìn)樣1 μL，記錄峰面積，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果麝香酮的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 95.837 4 μg/g，RSD 為 0.93%，表明重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品溶液，室溫放置，分別在 0、2、4、8、12 h取樣10 μL在高效液相色譜儀上進(jìn)樣，記錄色譜圖中秦皮甲素和秦皮乙素峰面積，計(jì)算其RSD分別為0.55%、0.30%。結(jié)果表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，滿足測(cè)定要求。

取樣品溶液，室溫放置，分別在 0、2、4、8、12 h取樣1 μL在氣相色譜儀上進(jìn)樣，記錄色譜圖中麝香酮峰面積，計(jì)算其RSD為0.84%。結(jié)果表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，滿足測(cè)定要求。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)定秦皮甲素和秦皮乙素量的樣品約0.5 g，6份，分為3組分別精密加入對(duì)照品溶液秦皮甲素(0.201 6 mg/mL)+秦皮乙素(0.204 8 mg/mL)0.8 mL+2 mL、1 mL+1.5 mL、1.2 mL+3 mL，按上述樣品制備方法和色譜條件，制備加樣回收樣品溶液并注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

精密稱取已測(cè)定麝香酮量的樣品約2 g，6份，每?jī)煞莞鞣謩e精密加入麝香酮對(duì)照品溶液(0.152 0 mg/mL)1 mL、1.3 mL、1.5 mL，按上述樣品制備方法和色譜條件，制備加樣回收樣品溶液并注入氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9 樣品測(cè)定

取3批次樣品，按上述制備和測(cè)定方法進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，每份平行測(cè)定3次，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計(jì)算秦皮甲素、秦皮乙素以及麝香酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.3 Determination result of samples(n=3)

3 討論

曾參照文獻(xiàn)［10］選用甲醇-水作為秦皮甲素和秦皮乙素HPLC測(cè)定法流動(dòng)相，但秦皮甲素有雜質(zhì)峰干擾且秦皮乙素有拖尾現(xiàn)象，故選用文中流動(dòng)相，能得到較理想的分離效果。對(duì)秦皮甲素和秦皮乙素對(duì)照品溶液進(jìn)行光譜掃描，秦皮甲素的最大吸收波長(zhǎng)在334 nm處，秦皮乙素在344.4 nm處。綜合考慮發(fā)現(xiàn)在344.4 nm處秦皮甲素和秦皮乙素的峰形均較好且無(wú)干擾，故選取344.4 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

麝香酮是麝香的主要活性成分之一，在參考文獻(xiàn)［11-13］方法的基礎(chǔ)上，選用文中GC條件對(duì)麝香酮進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果較為理想。《中國(guó)藥典》一部“麝香”項(xiàng)下藥材所指為天然麝香且規(guī)定含麝香酮不能低于2.0%。本制劑中所用麝香為人工麝香，經(jīng)測(cè)定，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值為2.3%，符合藥典要求。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HPLC法同時(shí)測(cè)定八味秦皮丸中秦皮甲素和秦皮乙素以及GC法測(cè)定八味秦皮丸中麝香酮的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性良好，能夠?yàn)楸酒返馁|(zhì)量控制提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

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