劉喜平， 李沛清， 劉 勍， 吳紅彥

(1.甘肅中醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000;2.天水師范學院，甘肅天水 741000)

新藥參參康心膠囊源于名老中醫(yī)驗方，由水蛭等三味藥物組成，經現(xiàn)代制藥工藝加工而成，臨床應用多年，對冠心病、心肌梗死等心肌損傷性疾病有顯著療效，以往研究表明該制劑可減輕阿霉素(ADR)心肌毒性［1］及垂體后葉素(Pit)所致心肌損傷，其作用機理與抗氧化，清除氧自由基、調節(jié)ATP酶活性有關［2］，本文進一步探討了參參康心膠囊對小鼠缺血心肌超微結構及心肌線粒體Na+、Mg2+、Ca2+含量的影響，以期為臨床應用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 昆明種普通級健康小鼠，♀♂各半，體重(30.0±2.0)g，由蘭州大學醫(yī)學實驗中心提供。動物合格證號:醫(yī)動字第 14－005。

1.2 實驗藥物 參參康心膠囊:處方由水蛭等三味藥物按一定的比例組成。由蘭州中藥現(xiàn)代化工程技術中心及甘肅中醫(yī)學院科研實驗中心監(jiān)制，規(guī)格為每粒0.5 g(每粒相當于生藥1 g)，實驗時用生理鹽水溶解為120 mg生藥/mL。地奧心血康膠囊:成都地奧制藥集團有限公司，批號:0503079代號022，國藥準字:Z10910051。

1.3 試劑及儀器 勻漿介質，參考文獻法［2］配制備用。52羥葵酸(美國sigma公司)。電子天平(Sartorius BL150，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);離心機(D－37520，德國);數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH－4，鄭州杜甫儀器廠);紫外分光光度計(UV－9100，北京瑞利分析儀器公司);透射電鏡:規(guī)格型號:JEM－1230，日本產。CCD相機:美國GATAN公司產。

2 方法

2.1 動物分組及給藥 將小鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組(地奧心血康組)、心肌缺血模型+參參康心膠囊(小劑量組、中劑量組、大劑量組)，每組10只。參參康心膠囊劑量按50 kg成人常規(guī)劑量折算后作為中劑量組(3 g生藥/kg體重)，高劑量組為中劑量組放大一倍(6 g生藥/kg體重)，小劑量組為中劑量組縮小一倍(1.5 g生藥/kg體重)。各劑量組每天灌胃2次，空白對照組及模型組每日給予相同體積的生理鹽水，連續(xù)5 d，陽性對照組按0.076 g/kg，1 mL/次灌胃。模型組及各用藥組小鼠在第5天灌胃30 min后腹腔注射Pit(劑量30 u/kg體重)［3］，空白對照組第5天腹腔注射等體積生理鹽水。

2.2 線粒體的分離 頸椎脫臼處死，取出心臟稱重，用冰冷的生理鹽水制成勻漿，4℃ 2 000 r/min離心10 min，取上清液，將此上清液再4℃ 10 000 r/min離心15 min，沉淀為線粒體，沉淀用20倍的冰冷勻漿介質制備成混懸液［4］。

2.3 心肌線粒體超微結構的觀察 動物分組、復制模型方法同上，注射Pit15 min后，參考文獻方法［5］，將手術摘取的心臟剪去心房部，在冰的磷酸緩沖液中洗去血液，切成小塊(1 mm3)，分別置于3%戊二醛中固定。按電鏡常規(guī)制作方法將切成小塊的心肌組織在1/15 mol的磷酸緩沖液中漂洗3次，每次10 min;漂洗后用1%鋨酸固定1 h 20 min;再次用1/15 mol的磷酸緩沖液漂洗3次，每次10 min;逐級用50%、70%、80%、90%、100%的乙醇脫水各 10 min;后用100%丙酮脫水10 min;以1∶1的比例用包埋劑EPON包埋浸透2 h;在35℃、45℃、60℃條件下各聚合24 h;用超薄切片機切片，厚度為60～80 nm;用飽和醋酸鈉及枸櫞酸鉛雙染色(雙染法)透射電鏡觀察與攝片。

2.4 線粒體的形態(tài)計量分析 參考文獻方法［6］，每只小鼠觀察2個銅網(wǎng)，每個銅網(wǎng)照2張底片，放大倍數(shù)均為20 000倍。各組電鏡底片應用HPIAS－1000圖文分析系統(tǒng)進行形態(tài)計量分析，計算線粒體的體密度(即線粒體體積與胞質體積的比值)、比表面(線粒體外膜面積與線粒體體積之比)、面數(shù)密度(參照系截面單位內的顆粒數(shù)目)。

2.5 心肌線粒體Na+、Mg2+、Ca2+含量的測定 取少量線粒體沉淀用硝酸消化后，用原子吸收分光光度儀測定其鈉、鈣、鎂含量。其吸收量與含量成正比，與標準系列比較進行定量。

2.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計，用t檢驗。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示。

3 結果

3.1 各組小鼠心肌細胞線粒體超微結構的改變 結果見圖1。經透射電鏡觀察，空白對照組心肌結構正常，粗細肌絲排列整齊有序，清晰完整，肌節(jié)整齊，線粒體大小形態(tài)正常，內部嵴排列有序，結構清晰完整可見;模型組肌絲排列疏松，肌節(jié)不清晰，不完整，有明顯的肌絲融合，形成多處肌融灶線粒體不完整，有多處腫脹破裂，線粒體嵴模糊，斷裂融合，形成空泡;陽性對照組顯示肌節(jié)整齊，肌絲無疏松現(xiàn)象，線粒體致密呈凝聚狀，線粒體嵴結構不清晰，排列致密;小劑量組肌絲輕度疏松，但肌節(jié)基本整齊，線粒體較完整，線粒體嵴排列結構尚清晰完整;中劑量組和大劑量組均顯現(xiàn)肌節(jié)整齊，肌絲排列有序，肌膜平整，其中，中劑量組線粒體大小形態(tài)較正常，無腫大表現(xiàn)，嵴結構基本清晰完整;大劑量組線粒體大小形態(tài)正常，線粒體嵴排列基本有序，結構清晰。

圖1 小鼠心肌細胞線粒體超微結構的改變

3.2 各組小鼠心肌細胞線粒體的形態(tài)計量分析 結果見表1。模型組體密度明顯增大，面數(shù)密度、比表面均減小，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與模型組比較，各用藥組體密度均減少，面數(shù)密度、比表面均增大，參參康心膠囊大劑量組作用明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而參參康心膠囊小、中劑量組與陽性組相比差異無統(tǒng)計學意義。

表1 各組小鼠心肌細胞線粒體的形態(tài)計量分析結果(± s，n=40)

表1 各組小鼠心肌細胞線粒體的形態(tài)計量分析結果(± s，n=40)

注:與空白組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.01。

組別 體密度/% 面數(shù)密度/μm－2 比表面/μm －1空白組32.79±5.54 0.871±0.150 32.75±7.23模型組 48.65±8.64* 0.791±0.119 25.57±7.30*小劑量組 37.82±5.83 0.741±0.098* 28.12±4.15*中劑量組 35.84±7.31* 0.776±0.112* 27.84±4.41*△大劑量組 34.28±6.53*△ 0.837±0.121* 32.55±6.65△陽性組 36.74±6.31* 0.790±0.123* 28.90±4.35*△

3.3 各組小鼠心肌細胞線粒體Na+、Mg2+、Ca2+含量 結果見表2。模型組的線粒體Na+與Ca2+濃度高于空白組，Mg2+濃度低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。參參康心膠囊各組及陽性對照組Na+與Ca2+濃度均低于模型組，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01);Mg2+濃度則高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，參參康心膠囊大劑量與中、小劑量間有劑量－效應關系(P＜0.05);參參康心膠囊中、小劑量間差異無統(tǒng)計學意義。

表2 各組小鼠心肌細胞線粒體Na+、Mg2+、Ca2+含量(± s，n=10)

表2 各組小鼠心肌細胞線粒體Na+、Mg2+、Ca2+含量(± s，n=10)

注:與模型組比較，*P＜0.05，△P＜0.01;與空白組比較，▲P＜0.01。

組別 Na+/(μg/mg) Mg2+/(μg/mg) Ca2+/(μg/mg)空白組15.48±4.25 14.38±3.35 2.01±0.56模型組 24.57±5.86▲ 8.85±2.68▲ 2.86±0.27▲小劑量組 24.35±4.18 9.43±2.64* 2.34±0.48*中劑量組 23.49±5.25* 10.21±2.98* 2.31±0.54*大劑量組 21.25±3.83△ 13.23±3.97△ 2.17±0.51△陽性組 23.26±5.36* 10.59±4.21△ 2.67±0.42*

4 討論

心肌缺血屬中醫(yī)“胸痹”、“心痛”范疇。中醫(yī)認為該病以本虛標實為其病理特征。本虛責之于氣、血、陰、陽不足，以心氣不足最為突出，標實主要涉及氣滯、血瘀、痰飲、寒凝、火熱等病理產物或因素，以心絡瘀阻為主。故氣虛血瘀是心肌缺血性疾病的主要發(fā)病機制，故以益氣養(yǎng)心，活血通絡為防治心肌缺血性疾病的基本治法。參參康心膠囊組方嚴謹，藥少力專，功能益氣養(yǎng)心，活血通絡，使氣旺促血行，祛瘀而不傷正。垂體后葉素收縮冠狀動脈，導致心肌供血不足，收縮全身小血管，導致心臟負荷加重，常用于誘導心氣虛證動物模型［7］，本研究選用該模型作為心肌缺血動物模型。

線粒體是維持機體細胞氧化及能量產生的重要功能單位，是一種膜性細胞器，其重要的生物學功能是氧化代謝和鈣代謝。線粒體對缺血、缺氧十分敏感，是清除氧自由基酶系統(tǒng)活力最重要的部位和決定細胞由可逆到不可逆改變的關鍵細胞器［8］。本實驗觀察到參參康心膠囊干預后心肌線粒體肌節(jié)整齊，肌絲排列有序，肌膜平整線粒體大小形態(tài)較正常，無腫大表現(xiàn)，嵴結構清晰完整。從形態(tài)學方面證實了參參康心膠囊保護缺血心肌細胞線粒體的結構與功能。

心肌缺血時發(fā)生細胞內外Ca2+分布的失衡，細胞內鈣超載是心肌缺血損傷的特征之一。線粒體對鈣離子的攝取主要是通過線粒體內膜兩側的電位差和鈣離子濃度差的驅動下完成，屬耗能過程，對維持胞質鈣濃度的穩(wěn)定有重要的意義。在缺血缺氧線粒體內膜一方面要攝取胞質超載的鈣離子，一方面要利用膜兩側的電位差合成ATP。在心肌缺血和缺氧的情況下，由于Na+K+－ATP酶被抑制，細胞內Na+也發(fā)生積聚，繼而發(fā)生Ca2+超載。本研究顯示:心肌缺血時，線粒體中鈉、鈣、鎂的含量出現(xiàn)不同程度的改變。Mg2+含量的減少，Na+、Ca2+含量增多，從而加重了能量代謝障礙。這與我們以往研究參參康心膠囊顯著提高Na+K+－ATP酶活性完全一致［2］。

線粒體的體密度為參考系統(tǒng)中線粒體所占的百分數(shù)，線粒體的面數(shù)密度是指單位參考系統(tǒng)中線粒體的數(shù)目，比表面是反映結構與功能關系最重要的形態(tài)參數(shù)。在相同表面積情況下，體積越大，比表面越小，反之體積越小，比表面越大，在相同體積情況下，球的比表面最小。本實驗發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血后，心肌線粒體等超微結構嚴重受損，其體密度明顯增大，而面數(shù)密度、比表面顯著減少，表明線粒體高度水腫，數(shù)量減少，線粒體膜及基本結構發(fā)生病變。從形態(tài)計量學測量結果來看，模型組體密度最大，面數(shù)密度、比表面最小，提示此組線粒體水腫最嚴重，超微結構的破壞也以模型組最重，與線粒體變化一致，而各用藥組較模型組體密度減少，面數(shù)密度、比表面增大，心肌損傷程度也較輕，參參康心膠囊各組可減輕缺血造成的心肌線粒體水腫，阻止缺血心肌膜損傷，維持膜結構的完整性，從而保護心肌超微結構，尤以參參康心膠囊大劑量組作用明顯。

［1］吳紅彥，張建剛，劉永琦，等.參參康心膠囊抗阿霉素心肌毒性的實驗研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2003，9(3):18－19.

［2］李沛清，王 燕，劉喜平，等.參參康心膠囊對缺血小鼠心肌線粒體損傷的保護作用［J］.中醫(yī)藥學報，2007，35(1):19－21.

［3］趙明奇，劉 艷，趙丹洋，等.通心絡改善缺血心肌供血的NO機制研究［J］. 中國實驗方劑學雜志，2003，9(6):43－45.

［4］斯佩克特.細胞實驗指南［M］.北京:科學出版社，2001:20.

［5］吳建新，王一心，鈕榮祥，等.心脈龍對大鼠異丙腎上腺素性缺血心肌的保護作用［J］.中國病理生理雜志，2002，18(1):97－98.

［6］李艷茹，彭 力，馬海英，等.非酶糖基化致衰老小鼠心肌超微結構和線粒體形態(tài)計量改變的研究［J］.電子顯微學報，2002，21(5):529－530.

［7］李紹芝，朱文鋒，黃獻平，等.心氣虛證動物模型的研制［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2000，6(7):466－471.

［8］雷 厲.大鼠缺血心肌線粒體損傷及其意義［J］.江西醫(yī)學院學報，1998，36(1):9－12.