吳明俠， 王晶娟， 張貴君*

(1.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102)

野菊花Chrysanthemi Indici Flos是常用中藥，功效清熱解毒。實驗研究發(fā)現(xiàn)，其清熱解毒的藥效組分主要是黃酮和有機酸類化合物。目前，野菊花中成分的研究多是對總黃酮及黃酮類成分的含量測定［1-7］，而有機酸類成分則只是測定其中綠原酸的含量［8-11］，且多采用有機溶劑進行提取，但傳統(tǒng)中藥臨床多是以水煎液用藥，故水提液中所含成分才是其臨床有效成分。

本試驗選擇不同產(chǎn)地的野菊花為研究載體，探討其水提液中黃酮類及有機酸類藥效組分同時測定的方法，旨在為中藥藥效組分分析方法的建立提供科學(xué)數(shù)據(jù)，為野菊花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供方法和思路。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀;Sartorius BP211D型電子天平;T-250B超聲波清洗機(天鵬電子新技術(shù)有限公司);FD-1型冷凍干燥機(北京博醫(yī)康技術(shù)公司)。

綠原酸對照品(批號:11075-200413)、咖啡酸對照品(批號:111885-200602)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品(批號:111720-200604)、蒙花苷對照品(批號:111528-200605)、木犀草素對照品(批號:11075-200512)，均購自中國藥品生物制品檢定所。3，5-二咖啡?？崴豳徸猿啥悸继厣锟萍加邢薰?，秋英苷為本實驗室自制，用質(zhì)譜確認并經(jīng)液相歸一化法標(biāo)定，含量為98.2%。

乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為屈臣氏純凈水。

野菊花:菊科植物野菊Chrysanthemum indicumL.的干燥頭狀花序，由北京中醫(yī)藥大學(xué)張貴君教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:A 相為0.5%磷酸水溶液，B相為乙腈，進行梯度洗脫，在0～10 min，B相從10%線性改變至20%，10～30 min，B相從20%線性改變至30%;30～40 min，B相從30%線性改變至40%;流速:1.0 mL/min;檢測波長:326 nm;柱溫:35℃。對照組分及供試品色譜圖見圖1。

圖1 野菊花HPLC色譜圖A.對照組分 B.野菊花樣品1.綠原酸 2.咖啡酸 3.木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷 4.3，5-二咖啡酰奎尼酸 5.秋英苷 6.蒙花苷 7.木犀草素Fig.1 HPLC chromotograms of Chrysanthemi Indici FlosA.Standard active components B.Chrysanthemi Indici Flos1.chlorogenic acid 2.caffeic acid 3.3，5-O-dicaffeoylquinic acid 4.luteolin-7-O-glucoside 5.apigenin-7-O-β-D-glucoside 6.buddleoside 7.luteolin

2.2 野菊花水煎劑的制備 取不同產(chǎn)地野菊花樣品20 g，精密稱定，加25倍量水浸泡10 min，煎煮2次，每次20 min，濾過，濾渣用水洗滌2次，合并水提液，濃縮至適量，置凍干機中制成凍干粉，收集凍干粉，精密稱定重量，計算提取率，備用。

2.3 對照組分溶液的制備 分別精密稱取7種藥效組分對照品適量，加甲醇溶解，配制成綠原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、秋英苷、蒙花苷、木犀草素濃度分別為0.122 4、0.027 2、0.295 2、0.056 4、0.043、0.262、0.022 mg/mL的混合對照組分溶液。

2.4 供試品溶液的制備 取不同產(chǎn)地野菊花凍干粉約0.5 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加水溶解，并稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.5 線性關(guān)系的考察 精密吸取對照組分溶液1、5、10、15、20 μL，按上述色譜條件測定峰面積;以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為:

綠原酸Y=3 424.68X－11.20，r=0.999 84;咖啡酸Y=2 507.11X+12.79，r=0.999 88;3，5-二咖啡?？崴醂=1 482.81X－8.65，r=0.999 91;木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷Y=3 032.28X+0.29，r=0.999 90;秋英苷Y=1 405.55X－9.09，r=0.999 72;蒙花苷Y=1 946.93X+54.14，r=0.999 91;木犀草素Y=2 393.07X－0.24，r=0.999 81。

結(jié)果表明，綠原酸在0.122 4～2.448 μg之間，咖啡酸在0.027 2 ～0.544 μg 之間，3，5-二咖啡?？崴嵩?.295 2 ～5.904 μg之間，木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷在0.056 4～1.128 μg之間，秋英苷在0.043～0.86 μg之間，蒙花苷在0.262 ～5.24 μg 之間，木犀草素在0.022～0.44 μg之間呈現(xiàn)良好的線性。

2.6 重復(fù)性試驗 精密稱取同一產(chǎn)地野菊花凍干粉5份，按2.4項下方法制備供試品，按2.1項下色譜條件測定含量(相當(dāng)于原藥材中，n=5)，綠原酸的含量為0.222 6%，RSD為1.55%;咖啡酸的含量為0.031 5%，RSD為1.84%;3，5-二咖啡?？崴岬暮繛?.220 1%，RSD為1.75%;木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量為 0.069 0%，RSD 為1.84%;秋英苷的含量為0.064 7%，RSD為1.63%;蒙花苷的含量為0.516 9%，RSD為1.36%;木犀草素的含量為0.014 2%，RSD為1.95%。

2.7 精密度試驗 精密吸取混合對照組分溶液10 μL，重復(fù)進樣5次，測定峰面積，綠原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡?？崴?、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、秋英苷、蒙花苷及木犀草素的RSD分別為0.88%、0.94%、0.81% 、0.74% 、0.62% 、0.99% 和 1.23% 。

2.8 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液5 μL，分別于配制后0、3、6、9、12 h測定各色譜峰峰面積。綠原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡?？崴?、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、秋英苷、蒙花苷及木犀草素的RSD分別為1.67%、1.40%、1.16%、1.78%、1.89%、1.65%和1.53%。結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率試驗 取已測定含量的安徽金寨野菊花藥材5份，每份0.8 g，精密稱定，分別精密加入對照組分適量，加25 mL水煎煮2次，每次20 min，濾過，濾渣洗滌2次，合并濾液，濃縮至10 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，按2.1項下色譜條件進行測定，計算各自的量。綠原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡?？崴帷⒛鞠菟?7-O-β-D-葡萄糖苷、秋英苷、蒙花苷及木犀草素的平均回收率分別為98.07%、98.73%、98.12%、98.59%、98.24%、98.75% 和 98.31%，RSD分別為 1.96%、0.73%、1.01%、1.14%、1.10%、1.02%和1.00%。

2.10 樣品的含量測定 分別精密稱定不同產(chǎn)地野菊花凍干粉，按2.4項下方法制備供試品，按2.1項下色譜條件進行測定，進樣量為5 μL，計算含量。結(jié)果見表1、表2。

表1 不同產(chǎn)地野菊花含量測定(n=5)Tab.1 The contents of Chrysanthemi Indici Flos from various habitats(n=5)

表2 不同產(chǎn)地野菊花含量測定(n=5)Tab.2 The contents of Chrysanthemi Indici Flos from various habitats(n=5)

3 討論

3.1 采用HPLC法測定了野菊花水煎劑中黃酮類及有機酸類成分的含量。流動相曾對甲醇-磷酸水及乙腈-磷酸水系統(tǒng)進行了考察，最終采用乙腈-0.5%磷酸水系統(tǒng)進行梯度洗脫，能同時測定其中綠原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡?？崴?、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、秋英苷、蒙花苷、木犀草素7種成分的含量，并進行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明該方法簡便快速，精密度和重現(xiàn)性良好，回收率合格，可作為野菊花的質(zhì)量控制方法。

3.2 含量測定結(jié)果表明，不同產(chǎn)地野菊花水煎劑中

各成分含量差異較大。目前野菊花常用炮制工藝是先將其炒制后再曬干，而梅山、青山、古碑3個產(chǎn)地的野菊花是采集后直接曬干，未經(jīng)過炒制過程，其中3，5-二咖啡?？崴?、蒙花苷含量明顯較其他產(chǎn)地高。而其他產(chǎn)地野菊花中，3種有機酸類成分含量趨勢基本一致。一種成分含量高，其它兩種成分也相對含量較高。

3.3 2005年版中國藥典中野菊花項下是以蒙花苷作為其質(zhì)量控制指標(biāo)［12］，但目前市售野菊花多是炒制后曬干制成，其中蒙花苷含量要低于直接曬干的炮制品，因此單以蒙花苷的含量高低評價野菊花的質(zhì)量優(yōu)劣是否可行，野菊花中的藥效組分究竟是哪些成分，還需進一步探討。

［1］林春蕊.野菊花總黃酮的含量測定［J］.廣西植物，2002，22(5):467.

［2］陳 蕾，朱霽虹.HPLC法測定野菊花中蒙花苷的含量［J］.中國藥事，2005，19(2):97.

［3］錢頻非，葛 濱，王殿廣.高效液相色譜法測定野菊花中木犀草素的含量［J］.中國藥房，2005，16(22):1741.

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［5］張珊珊，彭艷梅，吳 艷.HPLC法測定夏桑菊顆粒中蒙花苷含量研究［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報，2007，13(4):79.

［6］宋宏剛，裴彩云，趙韶華，等.不同產(chǎn)地野菊花藥材中蒙花苷及總黃酮含量測定［J］.中成藥，2008，30(4):556.

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［9］袁學(xué)勤，遲靜波，胥 云.HPLC測定野菊花中綠原酸的含量［J］.中成藥，2005，27(4):493.

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［12］中國藥典［S］.一部.2005:219.