周 利， 陳桂琛， 史 萍*

(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237;2.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧 810001)

大黃屬于蓼科植物，性寒味苦，是我國常用中藥。大黃在傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論中具有“瀉熱通便、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利膽退黃”的功效?，F(xiàn)代藥理及臨床研究表明，大黃具有瀉下、抗菌、抗腫瘤、抗高血脂、降低血壓、健胃、利膽、保肝、強(qiáng)心、消炎、延緩機(jī)體衰老、清除體內(nèi)氧自由基、調(diào)節(jié)免疫等諸多作用［1-2］。

長(zhǎng)期以來藥用大黃來源依賴野生大黃。由于盲目經(jīng)營、貪婪濫挖，資源缺乏保護(hù)，致使野生資源幾近枯竭，有些品種如野生唐古特大黃陷入瀕危滅絕的境地［3］。為了更有效的開發(fā)利用這一資源并保護(hù)大黃種群，對(duì)野生唐古特大黃進(jìn)行人工栽培研究，分別選擇青海大黑溝、群加兩處作為實(shí)驗(yàn)基地。大黑溝和群加分地處青海省湟源縣東峽鄉(xiāng)和湟中縣拉脊山北坡，海拔約2 900 m，為高寒陰濕山區(qū)，年降水量300～600 mm，適合于大黃等藥用植物資源的栽培。

野生唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf，其主要有效化學(xué)成分是蒽醌類衍生物，包括蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等［4］。有文獻(xiàn)報(bào)道人工栽培二年、三年和四年生唐古特大黃蒽醌類化學(xué)成分的研究［5］，但尚未見一年期人工栽培唐古特大黃成分的報(bào)道。本試驗(yàn)研究和比較一年生和二年生人工栽培唐古特大黃蒽醌類成分變化，為滿足不同需求的人工種植大黃及收獲季節(jié)提供重要的科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料 對(duì)照用唐古特大黃樣品購于青海果洛藥材市場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)樣品分別為青海大黑溝(一年)、大黑溝(二年)和青海群加(一年)、群加(二年)人工栽培唐古特大黃，采摘期為9月份。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器 HP1100型高效液相色譜儀(Agilent，美國，儀器操作及數(shù)據(jù)處理配有3-D化學(xué)工作站)，色譜柱為 Alltima 4.6 mm ×250 mm，5 μm C18反相柱。紫外可見分光光度計(jì)(UV一265FW，日本島津);分析天平(DF京光學(xué)儀器廠)。

1.2.2 試劑 甲醇、乙腈均為色譜純，天津西華特種試劑廠;N，N—二甲基甲酰胺，分析純，北京昌化精細(xì)化工廠;乙酸鎂、氯仿和硫酸，分析純，北京化工廠;高氯酸，優(yōu)級(jí)純，天津市東方化工廠;無水硫酸鈉，分析純，天津市塘沽鄧中化工廠;雙蒸餾水(自制)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品 5種標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)如下:蘆薈大黃素(0795-9803);大黃酸(0757-200005);大黃素(0756-200110);大黃酚(0796-200208);大黃素甲醚(758-200006)。

1.3 測(cè)試方法

(1)液相色譜分析。流動(dòng)相:甲醇:1%HClO4水溶液(85:15);流量:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;進(jìn)樣量:10 μL。測(cè)定 5 種蒽醌類成分含量［6-7］。(2)UV法測(cè)定總蒽醌含量［8］。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的提取

2.1.1 游離蒽醌的提取 精確稱取0.200 g大黃

粉樣品(經(jīng)植物組織破碎機(jī)破碎后過60目)加30 mL氯仿在索氏提取器中回流，直到提取液無色?；厥杖苊?，用3.00 mL的乙腈定容殘?jiān)⒖诪V膜過濾后用于HPLC測(cè)定。

2.1.2 結(jié)合蒽醌的提取 2.1.1項(xiàng)游離蒽醌提取后的殘?jiān)?0%的H2SO42.5 mL于室溫振蕩水解5 min后加30 mL CHCl3回流1 h，取上清液。殘?jiān)肅HCl3洗至無色，合并CHCl3液加2.5 g Na2SO4，回收溶媒，用乙腈定容于5 mL量瓶，用微孔濾膜過濾后用于HPLC測(cè)定。

2.2 樣品的測(cè)試

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣HPLC測(cè)試和回歸 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置:精密稱取大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素各2.203 mg;2.873 mg;2.599 mg;3.068 mg;2.431 mg，用乙腈定容至10 mL量瓶得各標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置于冰箱備用。分別取各標(biāo)準(zhǔn)貯備液2、5、10、20、50、100、200、300、400 μL 混合，用乙腈定容至2 mL，得到9種濃度水平的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用以測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。標(biāo)樣HPLC圖譜如圖1所示，其濃度Y和峰面積X的計(jì)算關(guān)系結(jié)果如表1所示。

圖1 5種標(biāo)樣蒽醌成分的HPLC圖譜

2.2.2 樣品的紫外吸收測(cè)試 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精取大黃素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加甲醇溶解置10 mL量瓶中至刻度，搖勻作為貯備液。精取一定量的上述大黃素標(biāo)準(zhǔn)品貯備液用1%乙酸鎂甲醇溶液稀釋得5、10、15、20、25 μg/mL 的梯度液搖勻，在 510 nm 處測(cè)定吸收度，以吸收度(Y)與標(biāo)準(zhǔn)品大黃素的含量(X)計(jì)算，回歸方程為Y=30.625X－0.007 3，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3。

表1 5種標(biāo)準(zhǔn)蒽醌成分HPLC分析回歸結(jié)果

樣品在測(cè)試前，經(jīng)過如下的處理:稱取大黃粉(60目)0.2 g加20%的H2SO43 mL于100℃水浴中振蕩水解30 min，加30 mL CHCl3回流1 h，取上清液，殘?jiān)?0 mL CHCl3再回流0.5 h直至回流液無色，合并CHCl3液加3 g Na2SO4，回收溶媒，用1%乙酸鎂甲醇液溶解定容至10 mL，同前測(cè)定吸收度，按回歸方程計(jì)算含量。

2.2.3 各樣品的游離蒽醌的含量 2.1.1項(xiàng)提取液經(jīng)HPLC測(cè)定，然后根據(jù)峰面積計(jì)算個(gè)樣品中大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素含量，其結(jié)果如表2所示。

表2 樣品中游離蒽醌類化合物的含量(±s)

表2 樣品中游離蒽醌類化合物的含量(±s)

*n.d.=檢測(cè)不到

樣品源 蘆薈大黃素/% 大黃酸/% 大黃素/% 大黃酚/% 大黃素甲醚/% 總量/%果洛(市場(chǎng))0.007 752大黑溝(一年)0.001 519±0.000 081 0.082 246±0.004 032 0.003 8±0.000 211 0.018 589±0.001 123 0.006 173±0.000 311 0.112 327±0.023 653±0.002 346大黑溝(二年)0.000 747±0.000 032 0.006 692±0.000 342 0.003 076±0.000 142 3 0.008 902±0.000 625 0.004 236±0.000 156 0.104 595±0.004 356群加(一年)0.006 535±0.000 343 0.072 078±0.005 12 0.005 375±0.000 271 0.015 24±0.001 132 0.005 367±0.000 443 0.099 83 0.006 563±0.000 712群加(二年)0.000 309±0.000 017 n.d.* 0.000 983±0.000 046 7 0.005 642±0.000 294 0.073 179±0.003 568 0.003 455±0.000 207 0.001 816±0.000 138 0.005 544±0.000 279 0.017 922±0.001 823 0.003 643±0.000 345 0.105 93±

由表2的結(jié)果可以看出，隨著栽種時(shí)間由一年增加到二年，大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素這5種化合物的含量都有所增加;二年生人工種植樣品中，無論是結(jié)合或總游離蒽醌，大黑溝和群加人工種植的大黃已接近藥材市場(chǎng)上購買的成品大黃中的含量;從一年生大黃成分分析可以看出，大黑溝人工種植大黃中蒽醌類成分明顯高于群加種植的大黃，表明不同的生長(zhǎng)土壤和地理環(huán)境種植的大黃其成分有所不同。從表2中大黃素甲醚的比較可以看出，相對(duì)于其他成分而言，其一年期和二年期種植的大黃中含量變化比較小，而且比較接近市售成品大黃中大黃素甲醚的含量。

2.2.4 各樣品結(jié)合蒽醌的含量 同上測(cè)得各樣品中5種結(jié)合蒽醌類化合物的含量，結(jié)果見表3。通過各樣品中結(jié)合蒽醌類化合物含量的比較可以看出，人工種植大黃生長(zhǎng)期從一年增加到二年，無論在大黑溝還是群加種植，其5種結(jié)合蒽醌大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素都有顯著增加。對(duì)于一年期大黑溝和群加地區(qū)人工種植大黃，其結(jié)合大黃酸含量已超過市售成品大黃中結(jié)合大黃酸的含量。

相對(duì)于游離蒽醌含量，二年期人工種植大黃中結(jié)合蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚與市售成品大黃差2～3倍，而二年期大黃中結(jié)合大黃素甲醚的含量?jī)H為市售成品大黃的十分之一左右。從一年期增加到二年，大黑溝和群加地區(qū)種植的大黃中結(jié)合大黃素甲醚的增加量相對(duì)也比較少。

表3 樣品中5種結(jié)合蒽醌類化合物的含量(±s)

表3 樣品中5種結(jié)合蒽醌類化合物的含量(±s)

樣品來源 蘆薈大黃素/% 大黃酸/% 大黃素/% 大黃酚/% 大黃素甲醚/% 總量/%果洛(市場(chǎng))0.034 021大黑溝(一年)0.100 34±0.007 321 0.064 304±0.003 002 0.062 87±0.003 358 0.299 284±0.019 692 0.053 488±0.002 675 0.580 286±0.237 648±0.022 785大黑溝(二年)0.015 893±0.000 823 0.174 184±0.006 754 0.013 261±0.000 663 0.026 183±0.001 563 0.008 127±0.000 443 0.606 596±0.025 741群加(一年)0.039 503±0.002 177 0.511 092±0.028 537 0.013 437±0.000 712 0.035 856±0.001 927 0.006 708±0.000 532 0.118 795±0.005 582群加(二年)0.008 71±0.000 921 0.087 199±0.003 847 0.004 721±0.000 492 0.052 239±0.001 985 0.577 239±0.038 421 0.013 571±0.000 774 1 0.004 594±0.000 279 0.025 378±0.002 134 0.050 378±0.003 916 0.006 898±0.000 578 0.712 132±0.039 602

2.2.5 總蒽醌含量的測(cè)定 在用高效液相色譜對(duì)5種蒽醌類化合物進(jìn)行測(cè)定的同時(shí)，也采用紫外分光光度法對(duì)不同樣品中總蒽醌的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。由表4的結(jié)果和比較可以看出，人工栽培一年生大黃中總蒽醌的含量比市場(chǎng)購買的成品大黃有非常明顯的差異，大黑溝一年生不足對(duì)照樣品的三分之一，群加的不足四分之一，人工栽培兩年生大黃總蒽醌的含量雖然比市場(chǎng)購買的成品大黃略低，但差距不大，尤其群加兩年生大黃總蒽醌的含量已達(dá)到成品的95%左右。

表4 樣品中總蒽醌的含量(±s)

表4 樣品中總蒽醌的含量(±s)

樣品來源果洛(市場(chǎng)) 大黑溝(一年) 大黑溝(二年) 群加(一年) 群加(二年)總蒽醌含量/% 1.257 932±0.099 782 0.379 064±0.019 705 0.983 234±0.013 244 0.261 839±0.012 183 1.196 011±0.063 215

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用分步提取和處理、高效液相色譜分析和紫外分光光度法測(cè)試手段，通過比較青海省大黑溝和群加人工種植一年期和二年期大黃與果洛市售成品大黃中5種蒽醌類成分，可以得到如下的結(jié)論:

人工種植大黃栽培期從一年增加到二年間，大黑溝和群加人工種植的大黃中結(jié)合型和游離蒽醌成分大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素以及總蒽醌含量都有所增加;二年期人工種植大黃中其游離蒽醌含量比較接近市售成品大黃的含量，而結(jié)合型蒽醌含量與市售成品大黃中含量相比差異比較大;一年期人工種植的大黃，大黑溝人工種植的大黃中結(jié)合型蒽醌僅為市售成品大黃的三分之一左右，游離大黃素甲醚的含量比較接近市售成品大黃;群加人工種植的大黃中結(jié)合型蒽醌含量?jī)H為市售成品大黃的四分之一左右;一年生長(zhǎng)期人工種植大黃，無論是在大黑溝或群加種植，其結(jié)合型大黃酸含量均高于市售成品中結(jié)合型大黃酸的含量。

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