張祥偉， 陳佩虹， 金曉艷， 陳育堯， 黃添友， 佟 麗*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州 510515;2.廣東九天綠藥業(yè)有限公司，廣東河源 517000)

中藥超微飲片是隨著現(xiàn)代超微粉體技術(shù)的發(fā)展而興起的新型中藥飲片。它以中藥材細(xì)胞破壁為目的，使細(xì)胞內(nèi)有效成分快速、大量的釋放出來(lái)，提高了中藥材的利用率，從而可以減少臨床用量［1－2］。我們前期對(duì)小柴胡湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片化學(xué)成分溶出特性進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果表明超微飲片有效成分溶出速度顯著加快，水溶性成分、總黃酮及黃芩苷溶出量是傳統(tǒng)飲片的2倍左右［3］。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討小柴胡湯兩種飲片藥效學(xué)劑量的相關(guān)性，為中藥復(fù)方超微飲片的臨床使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物與試劑 小柴胡湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片(藥物組成:柴胡24 g、黃芩9 g、半夏 9 g、黨參 9 g、生姜9 g、大棗9 g、甘草9 g)由廣東九天綠藥業(yè)有限公司提供(批號(hào)20080901);卡介苗干混懸劑(Bacillus Calmette－Guerin，BCG，60 mg/支，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)2008－1);脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS，10mg/支，Sigma 公司);聯(lián)苯雙酯滴丸(北京協(xié)和藥廠，批號(hào)08040108);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(Alanine Aminotransferase Kit，中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào):091211－200907);天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(Aspartate Aminotransferase Kit，中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)090591－200908)。1640干粉(GIBCO，批號(hào)1279327);新生牛血清(GIBCO，批號(hào) 600202);噻唑藍(lán)(MTT，Sion－American Biotec，批號(hào)2497B516);二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma公司，批號(hào)20080126)。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，♂性，體重18～22 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):NO:0057746，SCXK(粵)2006－0015。

1.3 儀器 Anke TDL－40B型離心機(jī);Sartorius CP225D型電子天平;意大利ECHO LCD全自動(dòng)生化分析儀 ;英國(guó) RSBiotech GalaxyS 241－220 CO2培養(yǎng)箱;德國(guó)LEICA XDP－EC型倒置顯微鏡;日本O－lympus BH－2型顯微鏡;Sigma Diagnostics 201型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀;德國(guó)Leica EG1600型包埋儀;德國(guó)LEICA RM 2135型切片機(jī)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)免疫性肝損傷小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性的影響 取小鼠108只，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、聯(lián)苯雙酯組(0.15 g/kg)、傳統(tǒng)飲片1組(20.28 g/kg)、傳統(tǒng)飲片2組(10.14 g/kg)、傳統(tǒng)飲片3組(5.07 g/kg)、超微飲片1組(10.14 g/kg)、超微飲片2組(5.07 g/kg)、超微飲片3組(2.54 g/kg)。除空白對(duì)照組尾靜脈注射生理鹽水(0.1 mL/10 g)，其余各組按文獻(xiàn)［4－5］制備小鼠免疫性肝損傷動(dòng)物模型:各組小鼠尾靜脈注射BCG混懸液(劑量:50 mg/kg;濃度:5 mg/mL)。按表1劑量灌胃給予相應(yīng)藥物(20 mL/kg)，每天1次，連續(xù)10 d。第11天禁食不禁水12 h，尾靜脈注射脂多糖(LPS)7.5 μg/只。注射后12 h，眼球采血，常規(guī)分離血清，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清ALT、AST。

2.2 對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝臟、脾臟、胸腺臟器指數(shù)的影響 眼球采血后，立即取動(dòng)物肝臟、脾臟、胸腺，稱其濕重，計(jì)算各臟器臟器指數(shù)(臟器指數(shù)=臟器濕重/體重×100%)。

2.3 對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝臟病理變化的影響［6］取小鼠肝臟大葉，10%中性甲醛固定，脫水、包埋、切片、HE染色，制備病理切片，顯微鏡下觀察對(duì)肝臟病理?yè)p傷的影響。參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》分為正常、輕、中、重四個(gè)等級(jí)，各組分別計(jì)數(shù)。

2.4 對(duì)免疫性肝損傷小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響［7］各組隨機(jī)選取采血后小鼠3只，常規(guī)消毒后無(wú)菌取脾臟，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，過(guò)濾、離心，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至8×106個(gè)/mL。每組培養(yǎng)4孔，每孔加樣(200 μL)后，將96孔板置于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)68 h;取出96孔板，超凈臺(tái)下各孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出96孔板，各孔吸出培養(yǎng)液170 μL，加入等容積的DMSO，震蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(波長(zhǎng)545 nm)測(cè)各孔OD值。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法 所有數(shù)據(jù)用mean±SD表達(dá)，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用單項(xiàng)方差分析(One－way ANOVA):方差齊采用LSD法;方差不齊采用Dunnett T3法。計(jì)數(shù)資料采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)(K Independent Samples Test)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，傳統(tǒng)飲片臨床等效2倍劑量可顯著降低免疫性肝損傷小鼠ALT與AST水平，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05);超微飲片臨床等效0.5倍劑量亦能顯著降低免疫性肝損傷小鼠ALT與AST水平，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。聯(lián)苯雙酯可顯著降低造模動(dòng)物ALT水平(P＜0.05)，但對(duì)改善AST活性水平，與模型對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.069)。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響(±s)，n=12Tab.1 Effects on serum ALT and AST in immunological liver injury in mice(±s)

表1 對(duì)免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響(±s)，n=12Tab.1 Effects on serum ALT and AST in immunological liver injury in mice(±s)

與空白對(duì)照組比較，#P＜0.05;各給藥組與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別 劑量/(g/kg)臨床等效量/倍ALT/(mmol/L)AST/(mmol/L)－ － 40.9±4.9 116.2±9.3模型對(duì)照組 － － 116.6±32.2#234.9±30.4#聯(lián)苯雙酯組 0.15 25 48.7±13.7* 179.6±45.6超微飲片1組 10.14 1 61.1±25.3* 168.1±45.3*超微飲片2組 5.07 0.5 71.1±19.2* 179.0±23.5*超微飲片3組 2.54 0.25 135.6±53.4 258.5±44.5傳統(tǒng)飲片1組 20.28 2 47.3±14.5* 160.8±55.3*傳統(tǒng)飲片2組 10.14 1 67.1±24.0* 170.2±61.4傳統(tǒng)飲片3組空白對(duì)照組5.07 0.5 91.3±28.4 227.3±55

3.2 對(duì)免疫性肝損傷小鼠脾臟、肝臟、胸腺臟器指數(shù)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥10d后，肝損傷模型組與正常對(duì)照組比較脾臟指數(shù)顯著增大(P＜0.05)，說(shuō)明造模后脾臟增大、腫脹明顯，但各給藥組對(duì)肝臟、脾臟、胸腺臟器指數(shù)無(wú)顯著影響。見(jiàn)表2。

3.3 對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝臟病理變化的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超微飲片臨床等效劑量1倍與傳統(tǒng)飲片臨床等效劑量2倍及聯(lián)苯雙酯組，均可減輕肝臟損傷程度(病理照片見(jiàn)圖1，HE染色 ×10倍)，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

3.4 對(duì)免疫性肝損傷小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超微飲片臨床等效劑量1/2倍與傳統(tǒng)飲片臨床等效劑量1倍劑量時(shí)，皆可顯著抑制淋巴細(xì)胞的增殖，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

表2 對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝、脾、胸腺臟器指數(shù)的影響(±s)n=12Tab.2 Effects on organ index in immunological liver injury in mice(±s)

表2 對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝、脾、胸腺臟器指數(shù)的影響(±s)n=12Tab.2 Effects on organ index in immunological liver injury in mice(±s)

空白對(duì)照組與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別 劑量/(g/kg) 臨床等效量/倍 肝臟指數(shù)/(mg/g) 脾臟指數(shù)/(mg/g) 胸腺指數(shù)/(mg/g)58.3±4.1 3.59±0.57 3.39±0.59模型對(duì)照組 － － 55.5±3.4 5.38±1.01* 2.69±0.62聯(lián)苯雙酯組 0.15 25 53.1±2.7 5.17±1.01 2.64±0.35超微飲片1組 10.14 1 55.5±3.7 6.38±1.92 2.74±0.63超微飲片2組 5.07 0.5 55.2±6.4 5.50±0.73 2.88±0.63超微飲片3組 2.54 0.25 60.5±4.5 5.04±1.02 2.21±0.50傳統(tǒng)飲片1組 20.28 2 61.0±13.9 5.59±1.90 2.61±0.84傳統(tǒng)飲片2組 10.14 1 59.1±7.8 6.36±1.76 2.71±0.69傳統(tǒng)飲片3組空白對(duì)照組 － －5.07 0.5 58.7±6.3 4.62±0.93 2.50±1.13

表3 對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝臟病理 變化的影響(±s)n=12Tab.3 Effects on liver pathological change in immunological liver injury in mice(±s)

表3 對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝臟病理 變化的影響(±s)n=12Tab.3 Effects on liver pathological change in immunological liver injury in mice(±s)

與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別 劑量/(g/kg)肝臟病理?yè)p傷分級(jí)臨床等效量/倍－ －12000模型對(duì)照組 － － 0 0 4 8聯(lián)苯雙酯組 0.15* 25 0 5 5 2超微飲片1組 10.14* 1 0 5 4 3超微飲片2組 5.07 1/2 0 2 5 5超微飲片3組 2.54 1/4 0 0 5 7傳統(tǒng)飲片1組 20.28* 2 1 7 2 2傳統(tǒng)飲片2組 10.14 1 0 3 5 4傳統(tǒng)飲片3組正常 輕度 中度 重度空白對(duì)照組5.07 1/2 0 0 5 7

4 討論

小柴胡湯具有和解少陽(yáng)之功，臨床用于治療少陽(yáng)病癥見(jiàn)往來(lái)寒熱、胸脅苦滿、默默不欲飲食、心煩喜嘔等?，F(xiàn)代研究具有保肝利膽、抗炎解熱、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用［8］，臨床廣泛用于病毒性肝炎的治療。病毒性肝炎以乙型病毒性肝炎最為常見(jiàn)，是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的世界范圍性疾病。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為是HBV感染人體后引起細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，激發(fā)自身免疫反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)功能紊亂導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷［9］，從而導(dǎo)致ALT、AST水平升高。本項(xiàng)研究采用BCG+LPS誘導(dǎo)的免疫性肝損傷動(dòng)物模型，BCG首先激活致敏T淋巴細(xì)胞，尤其是致敏肝內(nèi)Kupfer細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并大量聚集于肝臟;再注射LPS后進(jìn)一步激活致敏的巨噬細(xì)胞，促使其釋放大量細(xì)胞因子，如一氧化氮、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、自由基、白三烯等造成肝細(xì)胞損害［10］。該病理過(guò)程與人類病毒性肝炎中Kupffer細(xì)胞等非特異性免疫細(xì)胞在肝細(xì)胞內(nèi)浸潤(rùn)并釋放大量細(xì)胞因子造成肝細(xì)胞損害的病理過(guò)程比較相似，被認(rèn)為是研究乙型病毒性肝炎最公認(rèn)、經(jīng)典的動(dòng)物模型［11］。

圖1 小柴胡湯對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝臟病理的改變Fig.1 Effects on liver pathological change in immunological liver injury in mice

表4 對(duì)免疫性肝損傷小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(±s)n=4Tab.4 Effects on proliferation of spleen lymphocytes in immunological liver injury in mice(±s)

表4 對(duì)免疫性肝損傷小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(±s)n=4Tab.4 Effects on proliferation of spleen lymphocytes in immunological liver injury in mice(±s)

與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別 孔數(shù)/個(gè)臨床等效量/倍劑量/(g/kg) OD值－ 0.646±0.035模型對(duì)照組 4 － － 0.797±0.062聯(lián)苯雙酯組 4 25 0.15 0.609±0.039傳統(tǒng)飲片1組 4 2 20.28 0.506±0.073*傳統(tǒng)飲片2組 4 1 10.14 0.593±0.072*傳統(tǒng)飲片3組 4 0.5 5.07 0.627±0.111超微飲片1組 4 1 10.14 0.489±0.087*超微飲片2組 4 0.5 5.07 0.486±0.049*超微飲片3組空白對(duì)照組4－4 0.25 2.54 0.587±0.118

本實(shí)驗(yàn)采用免疫性肝損傷小鼠模型與脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，探討了小柴胡湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片藥效學(xué)作用的劑量關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小柴胡湯兩種飲片均可顯著降低免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性，減輕肝臟病理?yè)p傷程度，抑制脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，對(duì)肝損傷起到較好的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，超微飲片臨床等效劑量的1/2倍即可顯著降低ALT、AST水平，與傳統(tǒng)飲片臨床等效量2倍劑量效應(yīng)相當(dāng);在抑制脾淋巴細(xì)胞增殖方面，小柴胡湯超微飲片臨床等效劑量的1/2倍與傳統(tǒng)飲片臨床等效劑量1倍效應(yīng)相當(dāng)。病理是診斷、治療疾病及判斷預(yù)后的“金標(biāo)準(zhǔn)”，超微飲片臨床等效劑量1倍與傳統(tǒng)飲片臨床等效劑量2倍劑量，均可顯著減輕肝臟損傷程度，兩者效應(yīng)相當(dāng)。結(jié)合前期小柴胡湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片化學(xué)成分的對(duì)比研究，超微飲片水溶性浸出物、總黃酮及黃芩苷溶出量約為傳統(tǒng)飲片的2倍，參考本實(shí)驗(yàn)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議超微飲片使用劑量可以減少至傳統(tǒng)飲片使用量的1/2～1/4。

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