劉明義， 王勝春， 王俊琴， 田衛(wèi)斌， 曹增發(fā)

(中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院藥劑科，陜西西安 710032)

眾多研究認為CI/R可導致缺血及周邊區(qū)域神經(jīng)細胞壞死和凋亡共存，其發(fā)生機制復雜，多種因素參與了其發(fā)生與發(fā)展［1－3］。凋亡在缺血性損害中尤其是CI/R中起著重要作用［4－5］。抑制細胞凋亡的發(fā)生，對于減輕局灶性腦缺血再灌注損傷程度和范圍，減少腦梗塞體積和限制神經(jīng)細胞結構及功能的損害，改善中風患者預后有重要意義。歸延膠囊是由當歸、莪術、延胡索組成的中藥復方制劑，每粒內(nèi)容物相當于含生藥1.86 g，臨床一日3次，每次3粒，用于腦栓塞恢復期及后遺癥的治療，本實驗采用大鼠CI/R模型觀察歸延對凋亡及相關基因的影響，分析歸延治療腦缺血的作用機制，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠，體重(270±10)g，♂性，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，醫(yī)動證字SCXK(軍)2002－005。

1.2 材料 Fas、Fas－L、Bax、BcL－2、Caspase－3、9 引物合成(北京博邁);RT－PCR試劑盒(TaKaRa);細胞凋亡檢測試劑盒(Roche);Rabbit anti－Fas、Fas－L、gout Anti－Rabbit辣根酶標記 IgG(Santa Cruz);Rabbit anti－Bax、Bcl－2、Caspase－3、9(Boster)、Saper ECL Plas超敏發(fā)光液(普利來公司);膜聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore);紅四氮唑(TTC)(上海山浦化);半干轉膜儀(Bio－Rad);酶標儀(Biorad model 680，Japan);PCR擴增儀(USA PE);數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)(USA Alpha);紫外分光光度計(UV－2501PC)(日本島津);歸延膠囊(歸延)(西京醫(yī)院藥劑科生產(chǎn)，批號:20060815)。

1.3 大鼠腦中動脈腦缺血再灌注模型建立 取清潔級SD大鼠180只，依文獻［6］建立大鼠MCAO腦CI/R模型，術后隨機分為模型組，歸延2.00 g/kg組，另取大鼠90只，除不插線外，其余方法同上，為假手術組。大鼠清醒后灌胃(ig)給藥，假手術、模型組ig給予蒸餾水10 mL/kg;歸延組ig歸延2.00 g/kg。每天1 次，每組分為6 h、24 h、48 h、3 d、10 d、30 d時相點。

1.4 腦組織含水量的測定 取1.3項下每組每時相點大鼠6只，分別麻醉，迅速斷頭取腦，稱重，記錄。將腦組織置于80℃烘箱內(nèi)烘烤48 h，稱其干重，記錄，按EIIis公式計算含水量，腦含水量=濕質量－干質量/濕質量×100%進行計算。

1.5 TTC染色測定大鼠腦梗死面積及病理組織學標本制備 取1.3項下每組每時相點大鼠6只，分別麻醉，迅速斷頭取腦，以視交叉為中點，將其以冠狀面切成2.5 mm的腦片，置于5 mL含有4%TTC及1 mol/L K2HPO40.1 mL溶液中，避光，37℃溫浴40 min，正常腦組織為玫瑰紅色，缺血區(qū)為白色，4%的多聚甲醛固定12 h，數(shù)碼照相機拍照，Mias圖像分析軟件測定缺血面積比［Aa(%)］(缺血面積/全腦面積);組織常規(guī)脫水，包埋，用于HE及凋亡染色。

1.6 凋亡細胞原位末端標記法(TUNEL) 每組每時相點取6張切片，采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的帶生物素dUTP切口末端標記技術檢測凋亡細胞，以細胞核有明顯棕黃色為陽性細胞，標記切片在油鏡下定位，輸入細胞圖象分析系統(tǒng)，每張切片隨機選取50個視野，計數(shù)凋亡細胞和非凋亡細胞并計算凋亡率(凋亡率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))。

1.7 RT－PCR、Western Blot腦組織樣品制備 取1.3項下每組每時相點大鼠4只，分別麻醉，經(jīng)頸總動脈灌注冰冷生理鹽水20 mL，迅速斷頭取腦，置冰盤上分離損傷側皮層腦組織冠狀面一分為二，置液氮中放置24 h，移置－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 腦組織總RNA提取測定 取凍存腦皮層組織塊，每組每時相點取4個，按試劑盒說明書操作提取總RNA，經(jīng)測定A260/A280比值在1.8～2.0，取2 μg總RNA進行逆轉錄cDNA合成，以20 μL反轉錄產(chǎn)物作為PCR反應的模板。取上述總反應產(chǎn)物15 μL，行2.0%的瓊脂糖凝膠電泳，80V電壓電泳30～45 min，數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)分析儀采集圖像，薄層色譜掃描儀行條帶掃描，測定PCR產(chǎn)物峰面積，用公式計算mRNA產(chǎn)物的含量。產(chǎn)物的含量=擴增產(chǎn)物條帶的峰面積值/參照系統(tǒng)β－actin或GAPDH擴增產(chǎn)物條帶的峰面積值。PCR引物設計及反應條件，見表1。

1.9 Western Blot檢測腦組織蛋白的表達 取凍存的腦皮層組織，每組每時相點取4個，分別置于玻璃研磨器中加入1 mL組織裂解液，反復研磨使組織均勻地分散在裂解液中，置冰浴上裂解30 min，每隔10 min振搖一次。4℃ 12 000 r/min離心20 min，上清液即為組織蛋白提取液，BCA法定量，并調整各上樣量 25 μg蛋白/泳道，經(jīng) 10%SDS－PAGE 電泳，半干轉膜、封閉，分別與一抗(1∶300)雜交，4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)37℃孵育50～70 min，化學發(fā)光、壓片，采用Gel－pro Analyzer(BioRad)軟件計算目的蛋白表達的灰度值，以試驗組目的條帶灰度值/6 h模型組目的條帶灰度值的比值為蛋白表達水平。

1.10 統(tǒng)計學處理 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理，采用ANOVA分析，各組間比較采用t檢驗，試驗結果以±s表示，以α=0.05為顯著檢驗水準。

表1 定量RT-PCR引物合成序列Tab.1 Sequences of polymerase chain reaction primers and amplification conditions

2 結果

2.1 對CI/R時相點組織形態(tài)學的影響 光鏡下假手術組皮層組織結構完整，神經(jīng)細胞嗜色均勻，見圖A1、A2、A3。模型組CI/R 6 h大鼠腦皮層損傷側明顯充血，血管周圍間隙增寬，神經(jīng)細胞體積縮小，與周圍組織脫離，部分神經(jīng)元呈梭形，神經(jīng)纖維走向紊亂，間質輕度水腫，小膠質細胞激活，少量炎細胞浸潤，見圖B1;CI/R 24 h腦皮層損傷范圍擴大，損傷中心區(qū)大量神經(jīng)元細胞核固縮、偏位、胞漿呈空泡樣變性，膠質細胞活化，小膠質細胞明顯增生，間質水腫，少量炎細胞浸潤，見圖B2;CI/R 48 h腦皮層損傷側間質重度水腫，炎細胞浸潤明顯增加，小膠質細胞腫脹，神經(jīng)纖維斷裂，細胞間隙明顯增大，核深染，胞漿嗜酸性增多，見圖B3;CI/R 3 d腦皮層損傷側間質水腫明顯減輕，小膠質細胞明顯增生激活，炎細胞浸潤明顯增多，見圖B4;CI/R 10 d腦皮層損傷側壞死區(qū)呈結節(jié)狀分布，小膠質細胞大量增生，炎細胞大量浸潤，間質水腫明顯減輕，壞死邊緣區(qū)可見細胞核固縮明顯，深染，胞漿嗜酸性增多，見圖 B5;CI/R 30 d腦皮層損傷側間質水腫消失，壞死組織脫落后留下軟化區(qū)，在缺損邊緣區(qū)組織開始修復，見圖B6。與模型組CI/R各時相點比較，歸延對CI/R各時相點腦皮層損傷側組織有明顯改善作用，對30 d的改善作用優(yōu)為明顯，見圖C6。

2.2 對CI/R時相點大鼠腦梗死面積的影響 假手術組各時相點大鼠腦組織無梗死面積。與假手術組比較，模型組梗死面積在6 h已存在，24 h～3 d梗死面積基本一致，10 d有所降低。與模型組比較，歸延各時相點腦梗死面積均顯著降低(P＜0.05)，見圖2。

2.3 對CI/R時相點大鼠腦組織含水量的影響與假手術組比較，模型組CI/R 24 h后大鼠腦含水量明顯增加(P＜0.05)。與模型組比較，歸延組CI/R 6 h大鼠腦含水量顯著升高(P＜0.05)，24 h與模型組一致，48 h后腦含水量明顯降低(P＜0.05)，見圖3。

圖1 歸延對CI/R時相點腦皮層損傷病理組織學的影響Fig.1 Effects of Guiyan on the injury of pathologe histologe in cortex tissue of cerebral ischemia reperfusion at different times

2.4 對CI/R時相點大鼠神經(jīng)細胞凋亡率的影響與假手術組比較，模型組各時相點細胞凋亡率顯著增加，6 h～10 d呈上升趨勢，10 d達峰值。與模型組比較，歸延組48 h后均顯著低于模型組(P＜0.05)，見圖4。

圖2 歸延對腦組織梗死面積的影響Fig.2 Effect of Guiyan on the infarct area in brain tissue(±s，n=6，與模型組比較*P ＜0.05)

圖3 歸延對腦組織含水量的影響Fig.3 Effect of Guiyan on the brain water content(±s，n=6，與模型組比較*P ＜0.05)

圖4 歸延對腦皮層組織神經(jīng)細胞凋亡率的影響Fig.4 Effect of Guiyan on apoptosis rate of neural cell in brain cortex(±s，n=6，與模型組比較*P ＜0.05)

2.5 對CI/R時相點大鼠皮層凋亡信號通路mRNA表達的影響 與假手術組比較，模型組CI/R 24 h～ 30 d 腦皮層 Fas、FasL 、Bax、Bcl－2、Caspase－3、9 mRNA 表達明顯上調(P＜ 0.05)，F(xiàn)as、FasL、Bax、BcL－2 3 d 達峰值;Caspase－3、9mRNA 表達在 24 h為最高值。與模型組比較，歸延組Fas、Bax mRNA表達在3 d～30 d明顯下調(P＜0.05);FasL在各時相點均顯著下調(P＜0.05);BcL－2在6 h顯著降低，30 d 明顯上調(P＜0.05);Caspase－3、9mRNA 表達各時相點均顯著下調(P＜0.05)，見圖5。

圖5 歸延對CI/R相點大鼠皮層Fas、Bax、Caspase mRNA表達的影響Fig.5 Effects of Guiyan on the expression of Fas，Bax，Caspase mRNA in cerebral ischemia reperfusion at different times rats(±s，n=4，與模型組比較*P ＜0.05)

2.6 對CI/R時相點大鼠皮層Fas、FasL蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組Fas蛋白表達趨勢與假手術組一致，但各時相點表達水平均顯著上調(P＜0.05);FasL蛋白表達在時相點6 h、3 d、10 d顯著上調(P＜0.05)，24 h與48 h降低。與模型組比較，歸延組Fas蛋白表達在24 h后明顯下降(P＜0.05);FasL蛋白表達6 h、48 h明顯增加(P＜0.05)，3 d、10 d 表達明顯下降(P＜0.05)，見圖 6(a、b、c)。

2.7 對CI/R時相點大鼠皮層Bax、Bcl－2蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組Bax各時相點表達顯著升高(P＜0.05)，48 h為峰值;模型組 Bcl－2蛋白6 h表達顯著上調(P＜0.05)，與模型組比較，歸延組24 h后Bax表達顯著下調(P＜0.05)。Bcl－2 表達6 h、24 h明顯上調(P＜0.05)，見圖 7(a、b、c)。

圖6 歸延對CI/R時相點大鼠腦皮層Fas、FasL蛋白表達的影響Fig.6 Effect of Guiyan on the expression of Fas，F(xiàn)asL protein in cerebral ischemia reperfusion at different times rats(±s，n=4，與模型組比較*P ＜0.05)

圖7 歸延對CI/R時相點大鼠皮層Bax、Bcl-2蛋白表達的影響Fig.7 Effect of Guiyan on the expression of Bax，Bcl-2 in cortex of cerebral ischemia reperfusion at different times rats(±s，n=4，與模型組比較*P ＜0.05)

2.8 對CI/R時相點大鼠皮層Caspase－3、9蛋白表達的影響 與假手術比較，模型組Caspase－3蛋白表達6 h～48 h表達顯著高于假手術(P＜0.05);Caspase－9表達 6 h顯著增高，10 d顯著降低(P＜0.05)，與模型組比較，歸延組 Caspase－3 24 h、10 d表達顯著下調(P＜0.05)Caspase－9表達24 h、48 h顯著降低，見表圖 8(a、b、c)。

圖8 歸延對CI/R時相點大鼠腦皮層Caspase-3、9蛋白表達的影響Fig.8 Effect of Guiyan on the expression of Caspase-3，9 in cortex of cerebral ischemia reperfusion at different times rats(±s，n=4，與模型組比較 *P ＜0.05)

3 討論

目前認為凋亡是遲發(fā)性腦死亡的主要形式，凋亡在CI/R損傷的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。本實驗觀察CI/R各時相點皮層神經(jīng)細胞凋亡數(shù)顯著增多，組織學觀察顯示在CI/R早期神經(jīng)細胞核深染，胞漿嗜酸性增多和凋亡的表現(xiàn)形式TUNEL陽性細胞相平行，主要分布在椎體層、內(nèi)顆粒層、內(nèi)椎體層與多形層，CI/R損傷6 h～3 d腦皮層神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量并未隨CI/R時相點而增加，提示抑制CI/R凋亡應愈早愈好。試驗顯示腦梗死面積與凋亡率變化不一致，與腦含水量趨勢相似，提示腦梗死面積與神經(jīng)細胞壞死和凋亡有關。CI/R各時相點病理組織學顯示腦皮層組織損傷隨著炎癥級聯(lián)反應和自由基過量而加重，最終因神經(jīng)細胞壞死和凋亡形成軟化區(qū)。歸延組CI/R各時相點腦梗死面積降低，腦含水量下降，但CI/R 24 h無降低腦含水量作用。病理組織學顯示歸延明顯減輕CI/R誘導腦組織損傷的程度，在皮層未見成片軟化區(qū)，這與抑制腦皮層炎性反應和神經(jīng)細胞凋亡有關。

細胞凋亡是一個十分復雜的過程，它需要蛋白合成與信號轉導至核內(nèi)，其過程是在多種相關基因的調控下進行的，具有復雜、多樣性，應激不同、細胞不同、信號轉導途徑不同，這些信號通路之間相互作用，在體內(nèi)構成一個復雜的信號網(wǎng)絡。CI/R誘導神經(jīng)細胞凋亡途徑包括線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質網(wǎng)應激途徑，這三種途徑都通過激活Caspase家族成員，最終活化Caspase－3導致神經(jīng)元降解死亡［7－9］。Fas是一種促凋亡外源性基因，在細胞凋亡過程中發(fā)揮著傳導凋亡信號的作用，當細胞表面Fas過量表達時，可激活CTL細胞和神經(jīng)膠質細胞過度表達其配體FasL，使兩者結合并向細胞內(nèi)傳遞信號，最終通過 Caspase－8及 Caspase－3的激活而誘導凋亡的發(fā)生［10－12］。RT－PCR 試驗顯示 CI/R 各時相點腦皮層損傷側Fas、FasL mRNA表達明顯增加，二者表達水平趨勢一致，F(xiàn)as mRNA表達水平高于FasL mRNA;Western Blod試驗顯示Fas蛋白表達與基因表達相似，腦組織FasL蛋白3 d后明顯增加，表明CI/R激活缺血半影區(qū)神經(jīng)細胞過量表達Fas mRNA，同時激活膠質細胞表達FasL mRNA，F(xiàn)asL結合Fas激活胞漿內(nèi)Caspase級聯(lián)反應促進神經(jīng)細胞凋亡，試驗重現(xiàn)了CI/R誘導死亡受體信號通路介導了再灌注皮層神經(jīng)元凋亡，時間可持續(xù)數(shù)周。歸延可降低 CI/R各時相點 Fas、FasL mRNA表達，F(xiàn)asL表達上調而Fas減少，兩者結合減少受體凋亡信號通路被抑制，歸延降低神經(jīng)細胞凋亡的作用與減少Fas和FasL蛋白結合有關。

內(nèi)源性基因Bax和Bcl－2 mRNA對局灶性CI/R后細胞凋亡起著重要調控作用［13－14］。Bax 是 Bcl－2蛋白家族中的凋亡因子，Bcl－2蛋白主要定位于線立體外膜，它可拮抗Bax的促凋亡作用。細胞一旦受到凋亡因子誘導，Bax可向線粒體轉位，通過寡聚化在線立體外膜形成跨膜通道，或開啟線立體PTP孔，線立體中細胞色素C釋放并與脫氧腺苷三磷酸相互作用，與 Apaf－1結合激活下游的 Caspase－9酶原形成凋亡體。試驗發(fā)現(xiàn)Bax蛋白表達水平與基因表達態(tài)勢相似，Bcl－2蛋白表達與基因表達不一致，可能在蛋白翻譯、合成過程存在下降，在CI/R時程內(nèi)線粒體途徑誘導神經(jīng)細胞凋亡要早于Fas。歸延組在CI/R早可增加Bcl－2拮抗Bax促神經(jīng)細胞凋亡作用;Bax蛋白表達水平下降同時神經(jīng)細胞凋亡率降低，提示歸延降低CI/R誘導神經(jīng)細胞凋亡是通過降低Bax蛋白表達而實現(xiàn)的。

Caspase酶原的活化途徑主要包括死亡受體途徑和線粒體/細胞色素C途徑，Caspase－3、9為Fas/FasL和Bax共有的通路，是細胞凋亡執(zhí)行階段。歸延降低了凋亡信號轉導，使細胞凋亡率下降，試驗還發(fā)現(xiàn)在CI/R時相點10 d凋亡率高出各時相點一倍，而 Bax/Bcl－2、Caspase－3、9 表達卻下降，F(xiàn)as、FasL表達明顯增加，提示CI/R早期神經(jīng)細胞凋亡的可能是通過線立體與死亡受體途徑，中后期則是經(jīng)由死亡受體途徑。歸延降低CI/R誘導腦皮層神經(jīng)細胞凋亡的作用機制可能是通過調節(jié)Bcl－2/Bax、Fas/FasL和Caspase－3、9的活性而實現(xiàn)的。

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