張寶輝，馬騰，劉曉湘，方秀斌

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，沈陽 110001）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）為一由非特異性炎癥引起的以氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥為主要特征的慢性炎癥疾病。其發(fā)病機制比較復(fù)雜，許多炎性細胞、因子、介質(zhì)等均參與其發(fā)病過程。研究證明，神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）通過作用于炎性細胞、作用于神經(jīng)元，參與哮喘時的氣道炎性反應(yīng)、氣道收縮和氣道高反應(yīng)性的，最近有研究報道，Akt/PKB參與了哮喘發(fā)病機制中NGF介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路，本人以往的實驗也證明Akt/PBK能上調(diào)肺及C7-T5段脊神經(jīng)節(jié)及相應(yīng)脊髓后角內(nèi)IL-1β的表達［1］，也能上調(diào)肺組織內(nèi)血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達［2］，說明Akt/PBK很可能通過調(diào)節(jié)細胞因子IL-1β和VEGF的表達來參與NGF介導(dǎo)的哮喘發(fā)病機制。有研究證明，TNF-α通過激發(fā)細胞因子網(wǎng)絡(luò)造成細胞因子的級聯(lián)反應(yīng)，進而誘生其他的炎性介質(zhì)從不同的環(huán)節(jié)參與炎性反應(yīng)，引起器官組織損傷，是過敏性支氣管哮喘中的一個重要啟動因子［3］。但是Akt/PBK能否通過調(diào)節(jié)TNF-α分子的表達參與哮喘仍未見文獻報道，本研究利用免疫熒光、Western blot方法檢測TNF-α的表達來了解Akt/PBK能否通過調(diào)節(jié)TNF-α分子的表達參與哮喘。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及模型制備

雌性BALB/c小鼠30只，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。按隨機數(shù)字表法分為：（1）哮喘組10只，第1天每只小鼠腹腔注射20μg OVA（Sigma公司）和2 mg氫氧化鋁混合于0.5 ml PBS中，第8天、15天每只小鼠腹腔注射10μg OVA和1 mg氫氧化鋁混合于0.5 ml PBS中，第16天開始將小鼠置于封閉容器中，給予4%OVA（PBS配成）霧化吸入激發(fā)哮喘發(fā)作，每天 1 次，每次 25 min，連續(xù) 7 d；（2）Akt/PKB阻斷組，第19天開始霧化吸入前3 h鼻腔給 Akt/PKB 阻斷劑-LY294002（0.3 mg/kg），其余均與哮喘組相同；（3）正常對照組，以PBS代替OVA注射和霧化吸入，其余均與哮喘組相同。各組最后一次激發(fā)后24 h處死。

1.2 方法

1.2.1 AniRes2005肺功能儀測氣道反應(yīng)性：0.4%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠（80 mg/kg），疼痛反射消失后固定在小鼠體描箱內(nèi)操作臺上，氣管插管，游離頸外靜脈，行靜脈穿刺，固定針柄，封閉體描箱。乙酰甲膽堿（mAch）用磷酸緩沖液（0.1 mol/L Ph 7.4）配成 0.025、0.05、0.075、0.1 mg/kg 經(jīng)頸外靜脈各注射0.1 ml記錄波形和數(shù)據(jù)。

1.2.2 免疫熒光：將肺組織以恒冷箱切片機連續(xù)切片（片厚8μm），冷風(fēng)干燥后，室溫下血清封閉20 min，甩干，滴加一抗TNF-α（購自武漢博士德生物公司），4℃孵育過夜，PBS充分洗滌，滴加二抗（購自美國Sant Crutz公司），孵育40 min，PBS充分洗滌，甘油封片，選取3組動物的左肺相同部位的8張切片，每張切片選取六個區(qū)域，用OlympusBX51型熒光顯微鏡進行觀察。綠色熒光為陽性表達。

1.2.3 Western blot免疫蛋白印記：計算加樣量，加入樣品緩沖液，沸水浴中加熱5 min使蛋白質(zhì)變性，制備12%分離膠，4%濃縮膠，將樣品加在凝膠表面樣品槽中。電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉TTBS緩沖液4℃過夜。一抗TNF-α、β-actin（1∶200，）室溫孵育2 h，洗膜，辣根酶標記羊抗兔IgG-HRP（1∶5000，Santa Cruz）室溫孵育 1 h，洗膜后加入ECL（enhanced chemiluminescence）試劑（SantaCruz）反應(yīng)1 min，暗室曝光顯影后沖洗膠片。凝膠成像分析系統(tǒng)上攝像分析，測得目標帶的IDV（integrated density value），進而計算出各組樣品TNF-α目標帶的IDV與內(nèi)參照β-actin IDV的比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用x±s表示，組間比較進行t檢驗。檢驗水準 α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 哮喘模型制作結(jié)果

正常對照組霧化吸入生理鹽水后無明顯哮喘反應(yīng)，哮喘組動物在霧化吸入卵蛋白3次后，大部分哮喘發(fā)作，表現(xiàn)為呼吸頻率加深加快，肋間隙凹陷，刺激性嗆咳；Akt/PKB阻斷組動物，前3次霧化吸入卵蛋白后，大部分哮喘發(fā)作，應(yīng)用阻斷劑后，誘喘反應(yīng)不再明顯。

2.2 AniRes2005肺功能儀測氣道阻力

哮喘組小鼠對mAch的濃度反應(yīng)曲線明顯上移，其呼氣阻力和吸氣阻力顯著高于正常（P<0.01），表明哮喘小鼠對mAch的氣道反應(yīng)性顯著高于正常小鼠，表明哮喘模型建立成功。Akt/PKB阻斷組對mAch的濃度反應(yīng)曲線明顯低于哮喘組（P<0.01），提示Akt/PKB阻斷劑-LY294002對哮喘的氣道高反應(yīng)有阻斷作用（圖1，圖2）。

圖1 各組小鼠的吸氣阻力Fig.1 Inspiratory resistance measured with A ni R es 2005 pulmonary function meter in each group

圖2 各組小鼠的呼氣阻力Fig.2 Expiratory resistance measured with A ni R es 2005 pulmonary function meter in each group

2.3 免疫熒光

從免疫熒光圖片上可以看出，哮喘組小鼠的肺內(nèi)炎性細胞、氣道上皮（圖3B）的TNF-α的陽性表達量顯著高于正常對照組小鼠（圖3A），而Akt/PKB阻斷組（圖3C）則明顯低于哮喘組。而顯微圖像分析結(jié)果也表明，哮喘組TNF-α陽性反應(yīng)產(chǎn)物MOD值明顯高于對照組，Akt阻斷組TNF-α陽性反應(yīng)產(chǎn)物MOD值明顯低于哮喘組（P<0.01，表1）。

圖3 免疫熒光方法檢測各組小鼠TN F-α蛋白的表達 ×200Fig.3 Expression of TN F-αprotein detected by immunofluorescence in each group ×200

表1 各組小鼠的TN F-α蛋白的光密度值比較（x±s）T ab.1 Mean optical density of TN F-α in each group（x ±s）

2.4 Western blot結(jié)果

哮喘組小鼠肺組織TNF-α蛋白的光密度值為3.82±0.24，與正常對照組 2.51±0.12相比，表達量明顯升高（P<0.01）；Akt/PKB阻斷組TNF-α蛋白的光密度值為3.27±0.18，比哮喘組明顯減少（P<0.01），說明經(jīng)鼻腔滴入Akt/PKB阻斷劑（LY-294002）效果比較確切。

圖4 western blot方法檢測各組小鼠TN F-α蛋白的表達Fig.4 Expression of TN F-αprotein detected by W estern blot in each group

3 討論

本室以往的實驗發(fā)現(xiàn)，NGF能夠上調(diào)哮喘小鼠體內(nèi)SH2-Bβ和Akt的表達，提示在NGF介導(dǎo)的哮喘發(fā)病機制中，NGF上調(diào)其下游底物SH2-Bβ和Akt的表達是它參與哮喘發(fā)病機制調(diào)節(jié)的途徑之一［4，5］，以往的研究證明 Akt/PBK 能上調(diào)肺及 C7-T5段脊神經(jīng)節(jié)及相應(yīng)脊髓后角內(nèi)IL-1β的表達，也能上調(diào)肺組織內(nèi)TNF-Α的表達，說明Akt/PBK很可能通過對細胞因子IL-1β和TNF-Α的表達來參與哮喘的發(fā)病機制。

Tan等［6］報道，重度過敏性支氣管哮喘的TNF-α水平高于輕、中度患者，TNF-α水平越高，病情越重，也有研究證明TNF-α可通過轉(zhuǎn)錄因子（AP-1）而引起一些與炎性反應(yīng)有關(guān)的細胞因子、受體、酶的基因表達，引起氣道上皮細胞脫落，誘發(fā)或加重哮喘［7］。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α單獨作用不能誘導(dǎo)嗜酸性粒細胞趨化因子過多的釋放與表達，但如果與IL-13、IL-4協(xié)同作用可以使嗜酸性粒細胞趨化因子的釋放與表達是正常的20倍，表明TNF-α可顯著增加IL-13對嗜酸性粒細胞趨化因子的刺激作用，引起嗜酸性粒細胞的聚集［8，9］。還有研究發(fā)現(xiàn)，對現(xiàn)有治療不敏感的哮喘患者，其氣道腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達增高，在過敏性哮喘的研究中也發(fā)現(xiàn)，慢性抗原暴露可導(dǎo)致氣道TNF-α的產(chǎn)生。進一步的研究則證明，患者吸入TNF-α可增加氣道的反應(yīng)性，同時伴有嗜中性粒細胞性炎性反應(yīng)［10］。Barnes等［11］研究發(fā)現(xiàn)，哮喘急性期與緩解期痰液、支氣管肺泡灌流液或血清INF-α水平均明顯高于健康對照者，說明炎癥過程中TNF-α表達增加，在炎性細胞浸潤、激活中起重要作用，但是Akt/PKB蛋白能否通過調(diào)節(jié)TNF-α參與哮喘發(fā)病機制的調(diào)節(jié)，尚未見文獻報道。

在本實驗中，從免疫熒光結(jié)果可以看出，與正常對照組相比，哮喘組、Akt/PKB阻斷組小鼠肺內(nèi)炎性細胞、氣道上皮TNF-α的熒光表達量顯著高于正常對照組小鼠，而Akt/PKB阻斷組小鼠肺內(nèi)炎性細胞、氣道上皮的TNF-α的熒光表達量則明顯低于哮喘組，而Western blot結(jié)果也證明，哮喘組、Akt/PKB阻斷組小鼠肺組織內(nèi)TNF-α蛋白表達量明顯高于正常對照組，而Akt/PKB阻斷組TNF-α蛋白表達量比哮喘組則明顯減少，這結(jié)果提示Akt/PKB很可能是通過上調(diào)TNF-α的表達來參與NGF介導(dǎo)的哮喘發(fā)病機制。

本實驗的結(jié)果提示利用Akt阻斷劑直接或間接調(diào)節(jié)TNF-α的表達水平可能是治療哮喘的新途徑。

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