祝巖，王輝山，李新民，汪曾煒

（沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心臟血管外科，沈陽 110016）

橈動脈在全動脈化冠脈搭橋（coronary artery bypassgraft，CABG）手術中占有越來越重要的位置，但是橈動脈易于痙攣，影響患者術后橋血管近期和遠期通暢率。防治橋血管痙攣、保持橋血管的通暢成了臨床科研工作中一項重要內容。在體內研究血管組織收縮痙攣的病因、機制和防治措施，容易受到體內神經－體液以及各種藥物等多方面的影響。我們利用組織浴槽建立橋血管體外藥物敏感模型，研究單一因素改變對血管舒縮狀態(tài)的影響，取得了比較滿意的結果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橈動脈供體12例，全部為男性，年齡18~43歲，平均（29.5±10.7）歲，均無高血壓、糖尿病、心肌梗死等疾病。心功能（NYHA分級）均為I級。血管采集前2周內未接受任何藥物治療。取材時常規(guī)應用“notouch”技術，盡量避免動脈痙攣。阻斷血流或離斷血管后10 min內獲得目標血管，仔細觀察目標血管壁沒有動脈粥樣硬化性改變或者其他肉眼可見的疾病。立即保存在4℃Krebs-Ringer重碳酸鹽緩沖液中。低溫下簡單整理血管后，送往實驗室進行實驗。實驗所需苯腎上腺素、乙酰膽堿購自美國Sigma公司；Krebs-Ringer組織浴槽灌流緩沖液由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院制劑室提供。

1.2 模型制備

血管被送到實驗室后，繼續(xù)浸泡在4℃Krebs-Ringer液中，持續(xù)通入95%O2和5%CO2。整理橈動脈使其骨骼化，然后將目標血管切割成3~4 mm寬的血管環(huán)，要求務必保留血管內膜。用兩根不封口的三角形鋼絲相對方向分別穿過切好的血管環(huán)，鋼絲兩端牽引并在10 ml麥式組織浴槽（上海第三分析儀器廠）中水?。▓D1）。持續(xù)充入95%O2和5%CO2，調節(jié)溫度為37°C、pH7.4。鋼絲的一端連接靜息張力－位移探測換能器（San 45196-A型，日本NECSan Instrument公司），用以連續(xù)記錄等長靜息張力的變化。換能器另一端連接到多道生理信息采集處理系統(tǒng)（San 362型，日本NECSan Instrument公司）上，并通過生理信息記錄軟件（MEDLAB 6.0版）量化，以記錄實驗數據。鋼絲的另一端固定于可以精細調節(jié)被動張力的裝置上。給血管環(huán)加一個2.5~3.0 g的前負荷（由血管環(huán)自身的張力曲線確定，此張力下血管環(huán)不再繼續(xù)伸展，已經達到固有圓周數值的90%）。緩沖液每間隔15 min沖洗組織浴槽一次，直至所有血管環(huán)達到最佳靜息張力，維持相對穩(wěn)定的長度。Krebs-Ringer液基本成分及其濃度為：NaCl 118 mmol/L，KCl 4.9 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，KH2PO31.2 mmol/L，葡萄糖 5.5 mmol/L，EDTA 0.03 mmol/L。

2 結果

2.1 檢測血管環(huán)收縮活性

水浴槽中的血管環(huán)平臺期出現后，向組織浴槽中加入KCl溶液，直至水浴槽中K+終濃度為60 mmol/L，血管環(huán)產生明顯收縮證明血管環(huán)管壁平滑肌收縮活性良好，反之則棄之不用。量化血管環(huán)收縮力后，用緩沖液反復沖洗組織浴槽去除K+，待血管環(huán)恢復最初的舒張狀態(tài)后，再多次加入上述KCl溶液重復上述實驗過程，直至血管環(huán)連續(xù)2次的收縮幅度（產生靜息張力大?。┫嗖钤?0%以內，證明血管環(huán)已經穩(wěn)定，進入下一步實驗。

2.2 評估內膜組織的完整性試驗

已經確定處于平衡穩(wěn)定狀態(tài)下的血管環(huán)，排除其他會導致血管環(huán)收縮的影響因素。向組織浴槽中加入終濃度為10μmol/L苯腎上腺素，血管環(huán)產生收縮，待收縮穩(wěn)定后，再加入終濃度為20μmol/L內膜依賴性的血管舒張劑乙酰膽堿，血管環(huán)開始舒張。血管環(huán)的舒張程度達到上述平衡狀態(tài)下靜息程度的80%以上，認為其內膜是完整的或者說內皮功能是完好的，可以繼續(xù)下面的實驗。

2.3 繪制苯腎上腺素濃度－靜息張力收縮曲線

向組織浴槽中加入苯腎上腺素，使浴槽內液體終濃度達到0.1μmol/L，可以觀察到血管環(huán)產生一定的等長收縮，靜息張力加大。以－log M整倍數逐漸加大腎上腺素藥物的濃度，直至收縮程度不再增加，同時記錄此過程血管環(huán)的藥物濃度－靜息張力曲線（圖2）?？芍敱侥I上腺素濃度達到1 mmol/L時血管環(huán)產生完全收縮。再次用緩沖液將水槽沖洗干凈或者加入乙酰膽堿，血管環(huán)應該可以逐漸舒張，恢復至初始條件下的靜息張力。以苯腎上腺素不同半對數克分子濃度為橫軸，血管環(huán)在對應濃度下產生的靜息張力為縱軸，多個血管環(huán)靜息張力取平均值，繪制苯腎上腺素濃度－靜息張力收縮曲線。

圖1 麥氏水浴槽連接裝置及血管環(huán)掛鉤Fig.1 C onnecting device of organ chamber and hanger for radial artery rings

圖2 橈動脈苯腎上腺素濃度－靜息張力收縮曲線Fig.2 Mean concentration-contraction curves for M O in human radial artery rings

上述所有藥品均事先溶解于蒸餾水中，制備成母液，逐漸加入，研究中所有涉及的濃度均經過計算，已經考慮了添加液體對水浴管最終濃度的影響。藥物以半對數克分子濃度為梯度逐漸增加，下一個濃度增加的時機選擇在上個濃度梯度產生的收縮平穩(wěn)到達平臺期后，或者血管不產生新的靜息張力10 min后，直至血管環(huán)達到最大程度的收縮。

3 討論

隨著全動脈化CABG手術在全球范圍內的逐漸開展，橈動脈因為其管徑適當、遠期通暢率高、長期效果好，作為橋血管的應用而日益受到重視。但是橈動脈容易受到環(huán)境刺激、藥物作用等多方面的影響而極易發(fā)生痙攣，影響和限制了臨床上的廣泛應用。預防和治療橈動脈痙攣，保持管腔通暢，提高橈動脈近、遠期通暢率就成了當前臨床科研工作的一大熱點。人體血管組織在體內處于復雜多變的內環(huán)境中，不可避免的受到來自神經、體液、內分泌因子、甚至圍術期應用的各種血管活性藥物等多方面的作用和影響。因此在體研究血管組織收縮痙攣的病因、機制和防治措施，不能保證單獨一項或者幾項實驗影響因素對血管壁的作用，相互之間的可比性難以判斷。在體橈動脈的實驗研究也不符合醫(yī)學倫理要求。我們借鑒藥理學實驗中的組織浴槽，利用它可以比較完善的模仿體內內環(huán)境單一因素改變對血管舒縮狀態(tài)的影響。并且為了能夠在最大程度上保證實驗的嚴謹和可重復性，我們要求在實驗每一步開始前和結束后都要進行血管環(huán)收縮和舒張活性的檢測以及血管內膜完整性的檢測。

有研究證明橈動脈在血管分類上屬于Ⅱ類血管，也就是具有α腎上腺素受體的肌性動脈血管，其血管收縮主要依賴血管壁上的α受體調節(jié)，β受體分布較少［1］。因此我們在實驗中選用了主要激動α1受體的苯腎上腺素。由我們繪制的苯腎上腺素濃度－靜息張力收縮曲線可知，橈動脈在濃度為1 mmol/L苯腎上腺素的作用下可以產生完全收縮，該濃度遠大于在人體內的治療濃度。我們確定采用半對數克分子濃度（E50），即以10μmol/L作為標準。在本課題的后續(xù)實驗中，以此濃度作為刺激血管收縮的標準濃度，以便觀察血管環(huán)在不同藥物作用或預處理后的血管收縮反應，找到防治血管環(huán)痙攣的最佳方法。

與其他Ⅱ類動脈血管相似，橈動脈更容易產生痙攣。體外實驗證明，橈動脈對血管收縮藥物的反應性遠較胸廓內動脈或者大隱靜脈敏感［2］。首先，橈動脈血管壁α受體密度遠遠高于胸廓內動脈的血管壁，因而橈動脈較胸廓內動脈更容易受到α受體興奮劑的影響產生收縮性。Chardigny等［3］發(fā)現橈動脈與胸廓內動脈相比，前者對去甲腎上腺素有更強的收縮反應。第二，接受CABG手術患者在圍術期內環(huán)境常常出現兒茶酚氨類物質或者其他收縮血管介質釋放增多的現象，可為正常時的3~4倍，這種增高一般至少會持續(xù)24 h。再加上手術中常用的外源性血管收縮藥物如去甲腎上腺素、苯腎上腺素、大劑量的多巴胺等，都可以引起橈動脈血管的進一步收縮或者痙攣。最近有研究表明，起收縮主導作用的腎上腺受體為受體α1很少為α2，強調了人類橈動脈中α1受體功能研究的重要性［4］。第三，橈動脈還是一個厚壁、肌性的血管，平均厚度為500μm，而胸廓內動脈厚度僅為300μm［5］。橈動脈血管中層較其他血管中層明顯厚，因而產生的痙攣更加強烈并且難于恢復。橈動脈管壁有著更高的平滑肌細胞密度，平滑肌細胞分為數層，緊密連接在一起；胸廓內動脈的平滑肌細胞則較為松散的連接在一起，所以橈動脈具有更大的可收縮性［6］。第四，作為橋血管，橈動脈是沒有神經支配的血管，去神經使動脈血管壁對腎上腺素受體的刺激更加敏感，因此對α受體有更強的反應性［7］。第五，橈動脈血管壁內一氧化氮含量較其他動脈血管少［8］。這樣CABG手術中明顯增加的各種血管活性因子更強的作用于橈動脈使之痙攣也就不難理解了。鑒于受體介導是橈動脈痙攣的主要原因，在本研究中我們采用的血管痙攣藥是苯腎上腺素，其調節(jié)血管活動所作用的是腎上腺受體中最為重要的α1受體。幾乎所有的血管平滑肌都含有α1受體。平滑肌細胞α1受體激動時通過Gq/11蛋白→磷脂酶C激活→細胞內游離的Ca2+增多與蛋白激酶C激活而引起血管平滑肌收縮。人們在研究血管環(huán)恒流灌注模型中發(fā)現，血管α1-AR激動時信號轉導具有鈣依賴特性。細胞內游離Ca2+增加約90%來自細胞外Ca2+，通過敏感的電壓依賴性Ca2+通道內流。肌性動脈（如橈動脈）與彈性動脈比較有更多的α1腎上腺能受體，能更容易地引起血管收縮。

國外此類相關試驗中采用的血管痙攣藥是高鉀，其機制是直接興奮細胞膜電壓門控通道鈣離子泵，促進Ca2+內流，最終導致Ca2+增多與蛋白激酶C激活而引起血管平滑肌收縮。這種刺激方式忽略了動脈血管壁上α受體對血管舒縮狀態(tài)的調劑作用，雖然方式比較簡單，但我們認為在實驗中應用受體介導的血管收縮更有臨床意義。

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