佟冬怡，于泓波，李娜，魏會霞，張錦

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽 110004；2.沈陽市骨科醫(yī)院麻醉科，沈陽 110044；3.煤炭總醫(yī)院麻醉科，北京 100071）

內(nèi)毒素休克（endotoxin shock，ES）時，并發(fā)急性肺損傷（acute lung injury，ALI），肺血管受損，出現(xiàn)肺動脈高壓（pulmonary artery hypertension，PAH），有研究證實ES時肺血管張力增高，是導(dǎo)致PAH和肺水腫的產(chǎn)生的主要因素之一［1］。長托寧（penehyclidine hydrochloride，PHC）是一種新型抗膽堿能藥物，其選擇性阻斷M1，M3受體，近年來在內(nèi)毒素致急性肺損傷的保護作用成為熱點。而PHC對ES下肺血管張力變化的調(diào)節(jié)機制及給藥時機和量的選擇，目前報道較少。本研究旨在從離體水平觀察不同劑量PHC對家兔ES時肺動脈張力變化的影響，并探討其機制，為抗膽堿能藥物應(yīng)用于ES圍術(shù)期提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試劑：大腸桿菌內(nèi)毒素E.coli脂多糖（美國Sigma公司生產(chǎn)，型號 L2880）；KRB 液（Gibco公司，美國）；苯腎上腺素（深圳沃蘭德公司）；氯化乙酰膽堿（美國Sigma公司，批號A1049）；長托寧（成都力思特制藥股份有限公司，批號090701）。儀器：壓力換能器（Power Lab4/25T；ADI公司，澳大利亞），西門子900C呼吸機（德國），血氣分析儀（Bayer855），NO試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與動物模型：新西蘭大耳白兔30只，雄性，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實驗中心提供。隨機分為5組（每組6只，n=6）：（1）NS對照組（N 組）；（2）Ach對照組（A組）；（3）LPS 對照組（L 組）；（4）PHC（0.02 mg/kg）+LPS 組 （PHC2+L 組）；（5）PHC（0.45 mg/kg）+LPS組（PHC5+L組）。大耳白兔麻醉后呼吸機機械通氣股動脈經(jīng)壓力傳感器動態(tài)描記給藥前，給藥即刻（0 min），5 min，15 min，30 min 各時間點 MAP，并于30 min抽取股動脈血樣檢測血氣指標(biāo)。ES模型：除N組和A組外，其他3組均頸靜脈注射LPS（1 mg/kg）；PHC組LPS注入前15 min注入PHC（0.02 mg/kg，0.45 mg/kg）。注射 LPS后以 MAP低于 60 mmHg作為ES模型成功標(biāo)準(zhǔn)［2］，血氣分析PaO2/FiO2<300，為 LPS 致 ALI［3］。

1.2.2 離體肺動脈環(huán)張力測定：將處死動物心肺聯(lián)合取出，置于通入95%O2和5%CO2混和氣的4°C KRB液中。分離肺動脈，經(jīng)血管環(huán)活性及內(nèi)皮完整性檢測后，置于含有5 ml KRB（37°C）的恒溫浴槽中。連上張力換能器，調(diào)節(jié)血管環(huán)至最適張力，記錄平衡后的張力值。用PE 1μmol/L預(yù)收縮血管環(huán)，記錄預(yù)收縮值，N 組依次加入（0.01，0.1，1，10和 100 μmol/L）濃度NS，其余各組依次加入對應(yīng)濃度的Ach，記錄張力變化值。舒張反應(yīng)結(jié)果以舒張反應(yīng)百分比表示：（PE預(yù)收縮值-舒張值）/PE預(yù)收縮值×100%。

1.2.3 頸動脈血NO含量測定：各組動物分別于注入 LPS 前，注入即刻（0 min），5 min，30 min 各時間點抽取頸動脈血樣，檢測肺循環(huán)NO含量，按試劑盒說明操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料x±s表示。組間比較采用單因素方差分析，Graphpad grim 5.0繪制Ach劑量依賴性曲線圖，并計算Ach曲線的EC50和最大效能（Emax）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組注入LPS后MAP的變化

觀察30 min，N組和A組的MAP未隨時間而出現(xiàn)明顯變化，2組各時間點MAP也無明顯差異（P>0.05）；注入LPS各組MAP在給藥前及注入即刻無差異，但5 min時出現(xiàn)下降，明顯低于對照組（3組分別降至 52.78±4.020，52.97±3.146，49.89±1.801，P<0.01），并呈持續(xù)性下降，30 min時降至最低，均明顯低于對照組（3組分別降至30.88±0.921，31.26±1.967，30.96±1.513，P<0.01）；與 L 組比較，PHC2+L組和PHC5+L組在各時間點MAP均無差異，2組對LPS注入后MAP變化無影響（P>0.05）。見圖1。

圖1 各組注入N S或L PS后M A P變化Fig.1 C hange in mean arterialpressure after the in j ection of normalsaline or lipopolysaccharide in each group

2.2 各組PE預(yù)收縮后加入Ach的舒張反應(yīng)變化及各組EC50和Emax比較

除N組張力無明顯變化外，其余各組加入Ach后出現(xiàn)明顯舒張（P均<0.01）；與N組比較，除A組Ach0.01外，其余各組各劑量Ach均明顯引起肺動脈舒張作用（P<0.01）；與A組比較，L組可劑量依賴性引起Ach舒張反應(yīng)降低（P均<0.01），EC50增加（P<0.01），曲線右移；PHC2不能逆轉(zhuǎn)注入LPS后Ach的舒張反應(yīng)的降低，PHC2+L與L組EC50無顯著差異（P>0.05）；而PHC5組可逆轉(zhuǎn)注入LPS各劑量Ach引起的舒張反應(yīng)的降低，EC50減小，較L組有顯著性差異（P<0.01），而與低劑量PHC2比較，PHC5引起的各劑量Ach舒張均有顯著性差異（P<0.01），曲線右移。見圖2，表1。

圖2 兔肺動脈環(huán)對A ch舒張反應(yīng)百分比（x±s）Fig.2 Percentage of dilation of vascular ring in response to acetylcholine（x ±s）

表1 各組A ch劑量依賴曲線的E C50，EmaxT ab.1 E C50 and Emax of the dose-dependent curve for acetylcholine

2.3 各組肺循環(huán)NO含量測定

N組和A組靜注生理鹽水前及后各時點NO含量無明顯差異；與N組和A組對照組比較，注入LPS各組在給藥前及注入即刻NO含量無明顯差異，除PHC2+L組5 min外，3組5 min和30 minNO含量均明顯高于N組和A組對照組（P<0.01）；與L組比較，PHC5+L組在5 min和30 min測得NO含量明顯增高（P值分別為0.042和0.001 2），同時明顯高于PHC2組（P均<0.01）；L組和PHC5+L組含量于5 min時較前一時間點明顯增加（P值分別為0.028和 0.019），LPS 3組于 30 min均升至最高（P均<0.05）。見表 2。

表2 各時間點NO含量測定（x±s）T ab.2 NO content at each time point（x ±s）

3 討論

人和兔肺血管內(nèi)皮細胞或平滑肌細胞中分布有M1和M3受體，作用于肺血管內(nèi)皮細胞M受體，使血管舒張；作用于平滑肌細胞相應(yīng)M受體，引起血管收縮。內(nèi)毒素休克后，Ach大量釋放，但內(nèi)皮細胞中的M受體數(shù)量減少，影響NO的生成，Ach對肺血管內(nèi)皮依賴性舒張抑制；同時，LPS致肺血管平滑肌上M受體密度上調(diào)，Ach轉(zhuǎn)而通過直接刺激血管平滑肌上的M受體產(chǎn)生血管收縮作用［4］，加重肺循環(huán)阻力的增高。既往大量研究主要探討長托寧對肺組織NO含量變化影響，NO來源不同，濃度不同的NO可能在發(fā)病機理上有不同甚至相反的作用：李娟等研究證實預(yù)先使用長托寧，可減輕LPS造成的急性肺損傷，機制可能是抑制LPS引起的大鼠肺組織NF-κB 活性增加，抑制 eNOS 活性減少［6］；雷利榮等發(fā)現(xiàn)經(jīng)長托寧處理后的膿毒癥小鼠，肺組織iNOSmRNA含量明顯減少［7］。而本實驗從肺血管張力測定角度，觀察早期應(yīng)用不同劑量長托寧是否減輕內(nèi)毒素致肺血管張力增高，并同步檢測肺循環(huán)而非肺組織NO含量變化，探討預(yù)注入不同劑量長托寧對內(nèi)毒素休克肺循環(huán)的影響。

本實驗觀察到，Ach可劑量依賴性引起兔正常肺動脈的舒張反應(yīng)，內(nèi)毒素組肺動脈對Ach舒張反應(yīng)顯著減弱。內(nèi)毒素致ALI早期血液氧合已開始發(fā)生變化，因此應(yīng)早期進行有效藥物干預(yù)。長托寧注入體內(nèi)10 min后血藥濃度達到較高水平，20~30 min即可達到峰值血藥濃度，本研究觀察到注入LPS前15 min預(yù)注入大劑量長托寧，可有效改善LPS引起的Ach舒張反應(yīng)降低，而小劑量長托寧對LPS引起的Ach舒張反應(yīng)降低無此效應(yīng)，可能由于使用長托寧時，需達到一定劑量后才能發(fā)揮效果，M型受體被阻擋50%并不能影響乙酰膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能，阻擋70%時才明顯降低［8］。進一步觀察到，大劑量長托寧預(yù)處理后，肺循環(huán)NO較內(nèi)毒素組增加，推測大劑量長托寧可能保護血管內(nèi)皮細胞及其功能，肺血管內(nèi)皮細胞損傷減輕，從而使內(nèi)皮源性NO合成和釋放增加，調(diào)節(jié)肺血管的舒張。而長托寧是否阻斷平滑肌上的M受體密度的上調(diào)，致使內(nèi)毒素休克肺血管收縮反應(yīng)減弱，有待后續(xù)研究。另外，有研究認(rèn)為，抗膽堿藥物可引發(fā)某些副作用，如譫妄等，對大劑量應(yīng)用長托寧提出質(zhì)疑。術(shù)后譫妄是一種暫時性的認(rèn)知能力障礙和意識水平降低的精神狀態(tài)，且該癥狀發(fā)生率隨年齡增加而相應(yīng)增加，因此，高齡患者應(yīng)用大劑量長托寧仍需謹(jǐn)慎。大劑量長托寧雖有改善患者微循環(huán)，保護肺循環(huán)等積極作用，但其引發(fā)的相關(guān)副作用及利弊的權(quán)衡，仍需進一步實驗及臨床研究。

綜上所述，內(nèi)毒素休克后Ach介導(dǎo)舒張反應(yīng)降低，而預(yù)注入大劑量長托寧可逆轉(zhuǎn)此作用，這與改變肺循環(huán)NO含量有關(guān)，對內(nèi)毒素休克肺循環(huán)具有保護作用。

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