許玲芬，郭靜，滕旭，孫梅

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院兒科，沈陽 110004）

腸上皮細(xì)胞屏障是機(jī)體最重要的免疫防御屏障，是腸黏膜具有選擇性通透的基礎(chǔ)，用以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。目前發(fā)現(xiàn)腸上皮細(xì)胞的通透性增高與多種急慢性疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)［1］，如：炎癥性腸?。?］、敗血癥［3］、燒傷、終末期肝?。?］、重癥胰腺炎，甚至濕疹、食物過敏、1型糖尿病［5］、哮喘等。研究發(fā)現(xiàn)［6］血小板活化因子（platelet-activating factor，PAF）可以由腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生，存在于正常的小腸組織，并調(diào)節(jié)黏膜的通透性。當(dāng)給予小劑量PAF，在不足以引起腸損傷的情況下，可以增加腸黏膜的通透性，觸發(fā)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的活化［7］。因此，PAF被認(rèn)為是腸上皮屏障通透性增加的關(guān)鍵因素，但具體作用機(jī)制和方式還不明了。

本實驗應(yīng)用Caco-2細(xì)胞建立體外腸上皮細(xì)胞屏障模型，觀察PAF對其通透性的影響和超微結(jié)構(gòu)的改變，以探討PAF調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞屏障的作用位點和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要儀器及試劑

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株（Caco-2）購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，由ATCC引進(jìn)。主要儀器試劑有：Transwell（Corning，美國）；EVOM（Millipore，美國）；熒光分光光度計（日立，日本）；流式細(xì)胞儀（BD，美國）。DMEM培養(yǎng)基、胰酶和胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS）購自 Gibco公司；PAF、熒光黃購自 Sigma公司；細(xì)胞凋亡－Hoechst染色試劑盒由上海碧云天生物有限公司提供；Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測試劑盒由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，含15%進(jìn)口胎牛血清，1%青鏈霉素雙抗液，通入5%CO2（相對濕度90%），置37℃培養(yǎng)箱，傳代后7 d左右細(xì)胞生長達(dá)到融合開始進(jìn)行實驗，每種實驗均選取3組非同代細(xì)胞進(jìn)行。

1.2.2 腸上皮細(xì)胞屏障的建立：細(xì)胞接種于Transwell板上（直徑6.5 mm，孔徑0.4μm），接種密度為5×104/cm2，約 14~21 d，細(xì)胞形成緊密單層，跨上皮細(xì)胞電阻（transepithelial electrical resistance，TEER）明顯升高，證明腸上皮細(xì)胞屏障形成，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3 腸上皮細(xì)胞屏障通透性的檢測：Caco-2細(xì)胞形成單層上皮細(xì)胞屏障后，無血清培養(yǎng)24 h，在Transwell頂側(cè)加入不同濃度的 PAF（0，10，50，100，200 nmol/L）孵育24 h，檢測TEER及熒光黃透過量。

（1）TEER的測定：應(yīng)用EVOM參照文獻(xiàn)［8］測定Caco-2細(xì)胞的TEER。整個過程在恒定溫度下（37℃）進(jìn)行，每個Transwell均取不同方向的3個點，重復(fù)測定3次，取平均值即為該樣品的TEER值，以Ω/cm2表示；因為Transwell膜本身也具有一定的TEER，因此標(biāo)準(zhǔn)的TEER應(yīng)將樣品的實測TEER值減去空白對照的TEER值。

（2）熒光黃透過量的檢測：細(xì)胞用HBSS（pH7.4）小心沖洗3次，37℃孵育30 min，吸凈孔內(nèi)的HBSS以防止干擾；在Transwell頂端加入80μg/ml熒光黃，37℃孵育1 h后收集基底側(cè)液體，熒光分光光度計下測定吸光度（激發(fā)波長427 nm，發(fā)射波長536 nm），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算熒光黃濃度，結(jié)果以熒光黃的清除率表示。

Cl［nl/（h·cm2）］=Lab/（［LY］a×S）

Cl為清除率；Lab為頂側(cè)向基底側(cè)的熒光黃透過量；［LY］a為熒光黃的基礎(chǔ)量；S為 Transwell面積。

1.2.4 Annexin V-EGFP檢測細(xì)胞凋亡：各組加入處理因素后，采用Annexin V-EGFP/PI雙染色法，按照試劑盒操作步驟收集細(xì)胞、處理樣本，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，Annexin V-EGFP熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色；用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm；發(fā)射波長Em=530 nm。Annexin V-EGFP的綠色熒光通過FL1通道檢測；PI紅色熒光通過FL2通道檢測。

1.2.5 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡：各組加入處理因素后，采用Hoechst染色，按照試劑盒操作步驟收集細(xì)胞、處理樣本，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，可檢測到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長Ex=350 nm；發(fā)射波長Em=460 nm。

1.2.6 透射電鏡下觀察緊密連接（tight junction，TJ）：Caco-2細(xì)胞于2.5%戊二醛固定后，按常規(guī)病理學(xué)方法固定、脫水、包埋、切片后，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染，透射電鏡下觀察上皮細(xì)胞間緊密連接的變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗均重復(fù)3次以上，結(jié)果用x±s表示，統(tǒng)計由SPSS13.0軟件完成。采用One-Way ANOVA法比較組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利用Caco-2細(xì)胞建立腸上皮細(xì)胞屏障

Caco-2細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長，逐漸融合成片，成單層生長，光鏡下呈多角形、不規(guī)則多邊形或鵝卵石樣，相鄰細(xì)胞連接緊密，可見致密的反光帶（圖1A）。至21 d左右，細(xì)胞形成緊密單層，TEER值達(dá)到300~400Ω/cm2，對熒光黃透過量很小。電鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈高分化，細(xì)胞間形成緊密連接，呈致密的帶狀結(jié)構(gòu)，絨毛整齊，極性形成，成單層排列（圖1B）。體外腸上皮細(xì)胞屏障建立。

圖1 C aco-2單層上皮細(xì)胞Fig.1 C aco-2 epithelialcellmonolayer

2.2 PAF對Caco-2單層細(xì)胞TEER的影響

不同濃度PAF作用24 h后，TEER值下降，以100 nmol/L組下降最為明顯，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示PAF可以降低Caco-2細(xì)胞的TEER，但PAF濃度繼續(xù)增加（200 nmol/L）TEER并沒有繼續(xù)降低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖 2）。

圖2 不同濃度P A F對C aco-2單層上皮細(xì)胞T EE R和熒光黃透過量的影響Fig.2 Effect of different concentrations of P A F on T EE R and lucifer yellow flux in C aco-2 epithelialcellmonolayer

2.3 PAF作用Caco-2單層細(xì)胞后對熒光黃透過量的影響

正常Caco-2細(xì)胞對熒光黃的透過量很低，加入PAF后，從50 nmol/L開始，熒光黃的透過量即增加，但與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，PAF 100 nmol/L組熒光黃的透過量明顯增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。隨PAF的濃度繼續(xù)增加（200 nmol/L），熒光黃的透過量并未繼續(xù)增加（P<0.05）（圖 2）。

2.4 PAF對細(xì)胞凋亡的影響

圖3 A nnexin V-E G FP檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生Fig.3 A poptosis detected by A nnexin V-E G FP

圖4 H oechst細(xì)胞凋亡染色×400Fig.4 A poptosis detected by H oechst staining×400

應(yīng)用Annexin V和Hoechst染色試劑盒，應(yīng)用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測，均未發(fā)現(xiàn)給予PAF后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡增加（圖3，4）。

2.5 PAF破壞腸上皮細(xì)胞間的緊密連接

在正常Caco-2細(xì)胞，緊密連接位于細(xì)胞膜外側(cè)面的頂端，呈致密的帶狀結(jié)構(gòu)，相鄰細(xì)胞膜之間貼和緊密，沒有縫隙（圖5A）。加入PAF 100 nmol/L作用24 h后，緊密連接結(jié)構(gòu)破壞、斷裂，細(xì)胞間隙增寬，并可見細(xì)胞表面微絨毛脫落、稀疏（圖5B）。這些現(xiàn)象提示PAF可以破壞Caco-2細(xì)胞間的緊密連接，影響細(xì)胞極性。

圖5 透射電鏡下C aco-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變（箭頭所指為緊密連接，×4 000）Fig.5 U ltrastructural changes in C aco-2 cells（arrows show the tight j unction，×4 000）

3 討論

PAF是一種內(nèi)源性脂性介質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)特性。研究認(rèn)為PAF在諸多參與胃腸黏膜損害的炎性介質(zhì)中可能起到“中心放大”的介導(dǎo)作用。動物實驗證實PAF可引起腸黏膜通透性的增高［9］。用PAF和LPS引起的壞死性小腸結(jié)腸炎的改變相似，用PAF受體拮抗劑可明顯減輕LSP所致的腸壞死。也有實驗認(rèn)為PAF對內(nèi)毒素性休克有保護(hù)作用［10］。但PAF是否可以直接引起腸上皮細(xì)胞屏障通透性增高尚不清楚。

本實驗利用Caco-2細(xì)胞建立體外腸上皮細(xì)胞屏障模型，應(yīng)用TEER和特異性經(jīng)細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運的物質(zhì)熒光黃作為標(biāo)志物，聯(lián)合檢測了PAF對腸上皮細(xì)胞屏障通透性的影響。結(jié)果表明PAF50 nmol/L即可引起TEER的下降和熒光黃透過率的增加，PAF100 nmol/L達(dá)到高峰，但PAF濃度繼續(xù)增大（200 nmol/L）卻并未引起損傷的進(jìn)一步加重。表明一定濃度的PAF確實可以直接引起腸上皮細(xì)胞屏障通透性增高。

腸上皮細(xì)胞屏障主要由兩部分組成，即腸黏膜上皮細(xì)胞及其周圍的緊密連接。物質(zhì)通過腸上皮細(xì)胞有兩種途徑：一種為跨細(xì)胞途徑，另一種為旁細(xì)胞途徑。上皮細(xì)胞的凋亡增加勢必?fù)p害腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性，而旁細(xì)胞途徑的通透性高低則與細(xì)胞連接的狀態(tài)有關(guān)。

細(xì)胞凋亡早期的一個特征性變化是細(xì)胞膜的不對稱性喪失。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為35~36 kDa的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與PS有高度親和力，與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合，因此，Annexin V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一，是目前最為理想的凋亡定量檢測方法［11］。另外，細(xì)胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)會固縮，用Hoechst染色時，細(xì)胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，是一種快速簡便的檢測細(xì)胞凋亡的方法。通過細(xì)胞膜和細(xì)胞核染色聯(lián)合檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)即使大劑量的PAF也未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡增加。故本結(jié)果傾向于PAF引起的細(xì)胞屏障通透性增加是凋亡非依賴性的，其作用位點在旁細(xì)胞途徑。

透射電鏡觀察PAF對Caco-2細(xì)胞TJ形態(tài)學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)TJ在電鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞膜表面不連續(xù)的吻合點。正常Caco-2細(xì)胞在細(xì)胞接觸面頂端可見完整的緊密連接，加入PAF100 nmol/L作用24 h后，TJ發(fā)生斷裂，并可見細(xì)胞表面微絨毛脫落、稀疏，細(xì)胞內(nèi)吞飲小泡增多。這些現(xiàn)象說明：PAF可以破壞Caco-2細(xì)胞間的緊密連接，影響細(xì)胞極性。

總之，本研究結(jié)果顯示PAF可直接引起腸上皮細(xì)胞屏障通透性增加，該作用是凋亡非依賴性的，作用位點在旁細(xì)胞途徑，為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供了有力依據(jù)。

［1］Liu Z，Li N，Neu J.Tight junctions，leaky intestines，and pediatric diseases［J］.Acta Padiatrica，2005，94（4）：386－393.

［2］McGuckin MA，Eri R，Simms LA，et al.Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases ［J］.Inflamm Bowel Dis，2009，15（1）：100－113.

［3］Tsujimoto H，Onso S，Mochizuki H.Role of translocaion of pathogen associated molecular patterns in sepsis［J］.Dig Surg，2009，26（2）：100－109.

［4］崔巍，馬力，聞穎，等.暴發(fā)性肝衰竭時腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白 Occludin 表達(dá)下降 ［J］.世界華人消化雜志，2006，14（31）：3008－3012.

［5］Watts T，Berti I，Sapone A，et al.Role of theintestinal tight junction modulator zonulin in the pathogenesis of type I diabetes in BB diabetic-prone rats［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（8）：2916－2921.

［6］Hudry-Clergeon H，Stengel D，Ninio E，et al.Platelet-activating factor increases VE-cadherin tyrosine phosphorylation in mouse endothelial cells and its association with the PtdIns3'-kinase［J］.FASEBJ，2005，19（6）：512－520.

［7］Liu SX，Tian R，Baskind H，et al.Platelet-activating factor induces theprocessingof nuclear factor-kappa B p105 into p50，which mediates acutebowel injury in mice ［J］.Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol，2009，297（1）：G76－G81.

［8］Schmitz H，F(xiàn)romm M，Bentzel CJ，et al.Tumor necrosis factor-alpha（TNF）regulates the epithelial barrier in the human intestinal cell line HT-29/B6［J］.JCell Sci，1999，112（Pt1）：137－146.

［9］Tan XD，Chang H.Platelet-activating factor increases mucosal permeability in rat intestine via tyrosine phosphorylation of E-cadherin［J］.Br JPharmacol，2000，129（7）：1522－1529.

［10］Jeong YI，Jung ID，Lee CM，et al.The novel role of platelet-activatingfactor in protectingmiceagainst lipopolysaccharide-induced endotoxic shock［J］.PLoSOne，2009，4（8）：e6503.

［11］Liang F，Gao E，Tao L，et al.Critical timingof L-arginine treatment in post ischemic myocardial apoptosis role of NOS isoforms［J］.Cardiovasc Res，2004，62（3）：568－577.