王國麗，劉瑩，宿文輝，許琳，孫盧浩然，盧敏

（中國醫(yī)科大學 1.基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室；2.附屬第一醫(yī)院肛腸外科，沈陽 110001）

青蒿素于20世紀70年代由我國科學家從植物黃蒿中成功分離后，替代傳統(tǒng)抗瘧藥喹啉，成為世界范圍治療腦型瘧疾和惡性瘧疾的首選藥物。青蒿素及其衍生物具有抗寄生蟲、抗孕、抗腫瘤、抗纖維化、抗病毒、抗真菌、調(diào)節(jié)免疫和心血管系統(tǒng)等廣泛的藥理作用，其中的抗腫瘤作用近年來逐漸引起關注［1，2］。二氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）為青蒿素衍生物的主要活性代謝體，1998年美國國立癌癥研究所報告了在抗腫瘤藥物篩查項目中DHA對60種腫瘤細胞的細胞毒作用的檢測結果［3］。DHA的抗腫瘤作用，在不同的結腸癌細胞株得到驗證，并且發(fā)現(xiàn)可能通過線粒體途徑或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導細胞凋亡［3~6］。

本研究利用微陣列RTProfilerTMPCRArray Human Apoptosis和實時定量PCR方法，檢測DHA處理前后結腸癌細胞HCT116的84種凋亡通路關鍵蛋白的基因表達水平，以期全面認識并深入闡明DHA對結腸癌細胞的促凋亡分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

DHA購自中國藥品生物制品檢定所；細胞培養(yǎng)、RNA提純及反轉(zhuǎn)錄試劑主要購自寶生物和Invitrogen 公司；RTProfilerTMPCR Array Human Apoptosis（PAHS-012A）購自 SABiosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：結腸癌HCT116細胞株購自中科院上海生命科學院生物化學與細胞生物學研究所。培養(yǎng)條件：DMEM培養(yǎng)基含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素。培養(yǎng)箱37℃、5%CO2、100%濕度。

1.2.2 MTT實驗：DHA對HCT116細胞的生長抑制率通過MTT實驗測定。接種細胞于96孔培養(yǎng)板，細胞數(shù)5 000/孔。培養(yǎng)至24 h，更換加入不同濃度DHA的培養(yǎng)液。DHA濃度分別為0（對照組）、40、80、160μmol/L，每濃度設6個平行孔。加藥后24 h、48 h或72 h進行呈色反應。每孔加入MTT溶液（5 g/L）20μl繼續(xù)孵育 4 h，加入 150μl DMSO，振蕩 10 min后在492 nm處測定吸光度（Absorbance，A）。各濃度平行孔吸光度均值減去無細胞孔吸光度均值后，按下列公式計算細胞生長抑制率。

抑制率=［A（對照組）-A（用藥組）］/A（對照組）×100%1.2.3 凋亡基因表達圖譜檢測：接種等量HCT116細胞于直徑10 cm的細胞培養(yǎng)皿。培養(yǎng)24 h后細胞融合度約40%，更換培養(yǎng)基。DHA組細胞培養(yǎng)基內(nèi)DHA濃度80μmol/L，對照組細胞培養(yǎng)基未加入DHA。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，用Trizol（Invitrogen）提純RNA。然后用DNase I消化RNA樣品，去除可能存在的基因組DNA，并用RNeasy誖MinE－luteTM純化試劑盒（Qiagen）對獲得的RNA進行純化，再通過瓊脂糖電泳和紫外吸收測定法檢測RNA的質(zhì)量、濃度和純度。cDNA合成應用SuperScript.IIIReverse Transcriptase（Invitrogen），20 μl反應體系中加入總RNA 1.5μg。操作按照說明書進行。

cDNA 與 2倍 SuperArray PCR master mix（Cat.No.PA-112）充分混合，加10μl至PCR Array對應的每個孔中。實時定量PCR程序設置為變性95℃，10 min；擴增 40個循環(huán)，95 ℃ 15 s，60℃ 1 min。采集熒光，進行溶解曲線分析。

數(shù)據(jù)分析采用ΔΔCt方法。熒光閾值設定為0.15，取各 PCR Array管家基因 B2M、HPRT1、GAPDH 和 ACTB 的閾值循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct）均值為本底，按公式（1）計算ΔCt。ΔΔCt的計算公式為（2）。通過 2－ΔΔCt計算 DHA 組與對照組對應基因的表達差異［7］。

上調(diào)倍數(shù)（fold up-regulation）＞2為基因表達顯著上調(diào)，下調(diào)倍數(shù)（fold down-regulation）＜-2為基因表達顯著下調(diào)?；虮磉_上調(diào)及下調(diào)的定性結論具有可重復性。實時PCR微陣列實驗由康成生物工程有限公司（中國上海）提供技術服務。

2 結果

2.1 DHA處理的條件選擇及RNA樣品的鑒定

DHA作用于HCT116細胞的MTT實驗結果表明HCT116細胞的生長抑制率隨DHA濃度的增加及作用時間延長而升高，與文獻報道相符［5，6］，見表1。我們選擇80μmol/L 24 h做為DHA組細胞的藥物處理條件，該條件處理后的細胞生長抑制率約9%，絕大多數(shù)細胞處于凋亡前期，其基因表達改變可反映DHA誘導凋亡的分子機制。

表1 D H A對結腸癌細胞HC T116的生長抑制T ab.1 Inhibitory effect of D H A on cellgrowth in HC T116 cells

DHA組和對照組RNA樣品的Abs260/Abs280比值分別為2.00和2.02。變性瓊脂糖凝膠電泳照片上，DHA組和對照組的28S和18S核糖體RNA帶均亮而濃，前者密度大約是后者的2倍，而且能觀察到一個由低分子量RNA組成的略擴散帶（圖1）。Abs260/Abs280比值分析和變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定證實RNA樣品的純度和質(zhì)量符合微陣列研究的要求。

圖1 RNA樣品的變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定Fig.1 D enaturing agarose gel electrophoresis of RNA

2.2 DHA誘導的HCT116細胞凋亡基因差異表達

與對照組相比較，DHA組HCT116細胞被檢測的84種凋亡基因中，有35種基因表達水平顯著改變，即上調(diào)倍數(shù)高于2或者下調(diào)倍數(shù)低于－2。TNFα、TNFα、TRAILR、CASP、GADD45GADD45A 等 26 種基因表達顯著上調(diào)，而TP73、CASP2、Bcl2等9種基因顯著下調(diào)，見表2。

3 討論

本研究通過DHA誘導的凋亡基因表達圖譜結果表明：促凋亡基因中，TNFα、TNFR1、TRAILR、CASP10、CASP3、CASP4、GADD45 等基因表達顯著上調(diào)，CAPS6、P73、BIK等表達下調(diào)；抗凋亡基因中，BCL2、AKT、BAG1的表達下調(diào)，而一些IAP家族成員的基因表達上調(diào)2～4倍。

表2 D H A誘導結腸癌細胞HC T116凋亡基因的顯著差異表達T ab.2 Significantly differential expressions of apoptotic genes induced by D H A in HC T116 cells

結合本研究檢測到的凋亡基因顯著差異表達及他人的實驗結果［3～6，8～9］，我們提出了 DHA 誘導HCT116細胞凋亡的信號網(wǎng)絡假說（圖2）。DHA作用后HCT細胞內(nèi)部分促凋亡基因表達的顯著上調(diào)和部分抗凋亡基因的顯著下調(diào)提示DHA可能不同程度地依賴3條經(jīng)典凋亡途徑誘導HCT116細胞的凋亡，其一為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑；其二為TNFR1、TRAILR等死亡受體介導途徑；其三為線粒體途徑。Uhlemann等提出青蒿素可通過結合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+泵（SERCA），升高胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度發(fā)揮藥理作用，而且結合部位與SERCA1a的特異性抑制劑毒胡蘿卜素相同［8］。Lu等［4］則認為DHA可能通過鐵依賴的自由基產(chǎn)生促發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白的高表達。因此胞質(zhì)Ca2+濃度升高及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激則可能決定其復雜凋亡信號轉(zhuǎn)導的引發(fā)。此外，在DHA誘導HCT116細胞凋亡的過程中，存在BID蛋白作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和線粒體途徑的交叉點的可能性，胞質(zhì)Ca2+濃度升高及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以驅(qū)使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)BID蛋白轉(zhuǎn)位至線粒體誘發(fā)凋亡［9］。

圖2 D H A誘導HC T116細胞凋亡的信號網(wǎng)絡假說Fig.2 H ypothesis of D H A-induced apoptosis networ k in HC T116 cells

實時PCR微陣列技術結合實時定量PCR和其他DNA微陣列基因芯片的優(yōu)點，在一次實驗中能夠準確定量檢測上百個基因的mRNA水平。既克服了實時定量PCR檢測基因表達圖譜工作量大耗時久的缺點，又將檢測精確度提高到與實時定量PCR相當?shù)乃?，實驗結果無須再進行實時定量PCR驗證。本研究應用人凋亡實時PCR微陣列較全面地檢測了凋亡前期DHA對結腸癌細胞的凋亡相關分子的基因表達影響，增進了對DHA誘導結腸癌細胞凋亡機制的理解。經(jīng)過進一步驗證和完善，可望對DHA抗腫瘤藥物作用機制的研究帶來突破性進展。

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