郭鳳，孫威，姚陽，高青華，閔冬雨，封瑞，胡慧媛，蔡際群，郝麗英

（1.中國醫(yī)科大學藥學院藥物毒理教研室，沈陽 110001；2.沈陽醫(yī)學院生理教研室，沈陽 110034）

海馬是癲癇的重要致癇病灶之一，其CAl與CA3區(qū)錐體神經(jīng)元是癇性放電的初始位點［1］。研究表明，體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元在無鎂細胞外液的作用下可形成異常放電，而異常放電的作用機制并不清楚。離子通道結(jié)構(gòu)和功能的障礙均可引起癇性發(fā)作，而電壓依賴性鉀通道在保持神經(jīng)元的膜電位和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程中發(fā)揮重要作用［2］。延遲整流鉀電流（delayed rectifier K+current，IK）作為電壓依賴性鉀電流的重要組成部分，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是海馬部位。本研究擬通過“無鎂細胞外液”誘導原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元異常放電模型研究延遲整流鉀電流的變化，進一步探討無鎂誘導神經(jīng)元異常放電的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：新生24 h內(nèi)Wistar大鼠，雌雄不限，由中國醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

主要試劑與儀器：DMEM/F12培養(yǎng)基、NeurobasalTM-A-Medium、馬血清、B27（Gibco）、胎牛血清、D-Hanks液（Hyclone）、胰蛋白酶（Sigma）、FITC 標記羊抗兔 IgG （中杉）、倒置顯微鏡（Olympus）、Axopatch200B放大器（Axon Instrument）數(shù)模轉(zhuǎn)換器（Axon Instrument）。

1.2 方法

1.2.1 原代神經(jīng)元的培養(yǎng)：取新生24 h內(nèi)Wistar大鼠腦，顯微鏡下分離雙側(cè)海馬置于D-Hanks液；0.125%胰蛋白酶于37℃培養(yǎng)箱消化15～30 min。種植液（DMEM/F12+15%血清）終止消化，調(diào)整細胞密度為2×105/cm2后種植于2.0 cm×2.0 cm的蓋玻片上。3～4 d半量換飼養(yǎng)液（2%B27+NeurobasalTM-AMedium），體外培養(yǎng)1個月。

1.2.2 無鎂細胞外液誘導原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元放電：無鎂液（mmol·L-1）：NaCl 145，KCl 2.5，CaCl22，HEPES 10，Glucose 10，Glycine 0.001，用 NaOH 調(diào)pH 至 7.4。細胞外液（mmol·L-1）：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 10，Glucose 5.5，用NaOH 調(diào) pH 至 7.4。電極內(nèi)液 （mmol·L-1）：K-Aspartate 50，KCl 20，HEPES 20，EGTA 1，MgCl21，Ca－Cl20.2，NaCl 13.6，K2ATP33，KOH 調(diào) pH 至 7.4。將培養(yǎng)12 d后的神經(jīng)元放入“無鎂”細胞外液處理3h后，重新放入含鎂的正常細胞外液中培養(yǎng)。電阻為2～5 MΩ。利用膜片鉗電流鉗技術(shù)在I-Normal模式下，分別記錄神經(jīng)元在正常細胞外液、“無鎂”細胞外液3 h并恢復正常細胞外液的自發(fā)性發(fā)電活動。

1.2.3 膜片鉗技術(shù)記錄延遲整流鉀電流：培養(yǎng)細胞第12 d后，應用膜片鉗電壓鉗技術(shù)分別記錄神經(jīng)元在正常細胞外液、“無鎂”細胞外液3 h并恢復正常細胞外液的鉀電流。鉀電流的記錄方法：在V-clamp模式下，設(shè)定保持電位為-80 mV，以10 mV為步階使膜電位由-60 mV逐步去極化至+60 mV，持續(xù)時間300 ms，可記錄到外向電壓依賴性鉀電流。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 12.0統(tǒng)計學軟件進行處理，結(jié)果以x±s表示，兩組間比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)

神經(jīng)元12~24 h后大部分貼壁，隨時間延長形態(tài)多變，突起逐漸增多，培養(yǎng)第8天后，神經(jīng)元可見錐體形狀，有軸突與樹突，細胞富有立體感，細胞核呈空泡狀，核仁清晰可見。第10天后，細胞之間通過突觸聯(lián)系，可形成典型的神經(jīng)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖1），至28 d培養(yǎng)液中有懸浮的細胞碎片。

2.2 海馬自發(fā)性放電記錄

用正常細胞外液處理，可以記錄到神經(jīng)元（n=6）正常的自發(fā)性動作電位（圖2A）。經(jīng)無鎂細胞外液處理3 h并恢復正常細胞外液后，神經(jīng)元（n=6）可出現(xiàn)兩種自發(fā)性動作電位，一種是周期性的電壓幅度為50～80 mV“癲癇樣”自發(fā)性放電（圖2B），放電頻率為8～20 Hz；另一種是電壓幅度為50 mV左右的“楔形”放電（圖2C）。

圖1 大鼠海馬細胞的原代培養(yǎng) ×400Fig.1 Primary cultured rat hippocampal neurons×400

圖2 無鎂處理誘導培養(yǎng)海馬細胞癲癇樣放電Fig.2 Epileptiform discharge in cultured hippocampal neurons treated with Mg2+-free extracellular fluid

2.3 無鎂對延遲整流鉀電流的峰值與電流-電壓曲線的影響

延遲整流鉀電流為最后100 ms激發(fā)出的外向鉀電流的主要成分。用pClamp10.0計算出每個細胞的電容，電流值與電容之比為電流密度（pA·pF-1）。無鎂組（圖3B）可使對照組（圖3A）的IK峰密度值從（3.65±1.29）pA·pF－1增大到（9.09±2.41）pA·pF－1（與對照組比較，P<0.01，n=6）。以各命令電壓下的平均電流密度值（pA·pF－1）對相應的膜電位（mV）作圖，制得I-V曲線。結(jié)果顯示，無鎂組可增大不同膜電位下的IK平均電流密度，但曲線的形狀無明顯變化（圖4）。

3 討論

圖3 無鎂處理對延遲整流鉀電流的作用Fig.3 Effect of Mg2+-free extracellular fluid on IK

圖4 無鎂處理對延遲整流鉀電流電流-電壓曲線的影響Fig.4 Effect of Mg2+-free extracellular fluid on I-V curve of IK

研究表明，無鎂誘發(fā)的神經(jīng)元自發(fā)的動作電位與癲癇發(fā)作時電生理活動相似，可以產(chǎn)生反復循環(huán)的自發(fā)性“癲癇樣”發(fā)電，而抗癲癇藥物如苯巴比妥、苯妥英鈉等都可以阻滯這類動作電位［3，4］。本研究參照Sombati等的實驗方法，利用無鎂細胞外液模擬“癲癇微環(huán)境”，發(fā)現(xiàn)經(jīng)無鎂細胞外液作用3 h后，神經(jīng)元可周期性地出現(xiàn)電壓幅度為50～80 mV“癲癇樣”自發(fā)性放電和“楔形”放電，從而證實我們建立了癲癇神經(jīng)元模型。本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)神經(jīng)元必須形成突觸聯(lián)系與網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，具有傳遞信息的形態(tài)學基礎(chǔ)后，才能建立癲癇自發(fā)性發(fā)電的模型，而分散培養(yǎng)的海馬細胞沒有自發(fā)性動作電位。

因此，制備表面光滑、輪廓清楚、立體感強的神經(jīng)細胞是進行膜片鉗記錄的必要前提。本方法培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元具備適用膜片鉗研究的前提條件，特別是需要與少量的膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng)，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞之間具有一定程度的信息傳遞。此種培養(yǎng)條件下的的神經(jīng)元活性較強，封接率可達50%以上，為進一步的功能實驗奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

目前癲癇發(fā)病機制仍不清楚。鉀通道決定細胞膜的靜息電位、膜興奮性和動作電位的形狀與頻率，在癲癇研究中近年來愈加受到重視。研究表明鉀通道 KCNQ2/Q3、KATP、、KV1.1 在癲癇發(fā)病機制中起重要作用［5］。IK是一種重要的鉀電流成分，最初發(fā)現(xiàn)于烏賊巨軸突。哺乳動物腦中的IK電流由多種電壓依賴性鉀通道亞型構(gòu)成，包括KV1.1、KV1.2、KV1.5、KV2.1、KV2.2、KV3.1 和 KV3.2［6］。

以往眾多研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作誘導的神經(jīng)元活動增加、體內(nèi)缺氧、谷氨酸刺激和實驗性缺血能導致IK增加［7］。Huang等［8］發(fā)現(xiàn)抗癲癇藥左乙拉西坦在NG108-15細胞株中可以濃度依賴性的形式抑制IK并且使IK的穩(wěn)態(tài)激活曲線向去極化方向移動，可能是其在體內(nèi)具有抗癲癇作用的藥理機制之一。本研究顯示與對照組相比，無鎂組IK電流密度值增大，推測IK增大可能與無鎂誘導體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元自發(fā)異常放電的基礎(chǔ)病理機制相關(guān)，具體的相關(guān)機制則需進一步的實驗加以證明。

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