范斌，杜強，谷劍秋，張錦

（中國醫(yī)科大學1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110004；2.附屬盛京醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽 110004；3.附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽110001）

單核細胞通過內(nèi)皮細胞的間隙移入內(nèi)膜下并分化成巨噬細胞，巨噬細胞吞噬體內(nèi)過剩的脂質(zhì)后變成泡沫細胞，泡沫細胞聚集并形成斑塊是動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)［1，2］。研究表明，perilipin2與泡沫細胞的形成密切相關(guān)，在動脈粥樣硬化動物模型ApoE-/-鼠的實驗中，敲除perilipin2基因能顯著抑制泡沫細胞及斑塊的形成［3］，提示perilipin2是治療動脈粥樣硬化的理想分子目標，下調(diào)perilipin2的表達有助于減少泡沫細胞的形成。我們通過對一系列具有抗炎、抗氧化作用的天然化合物的篩選，發(fā)現(xiàn)法國海岸松樹皮提取物—碧蘿芷（Pycnogenol，PYC）能夠抑制油酸誘導的perilipin2的表達，并進一步探討了其相關(guān)分子機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

油酸（oleic acid，OA）（Wako Pure Chemical Industries，日本），perilipin2單克隆抗體（PROGEN Biotechnik，德國），GAPDH單克隆抗體、過氧化物酶耦聯(lián)羊抗豚鼠IgG及羊抗鼠抗體（Santa Cruz Biotechnology，美國），Western blot試劑盒（GE Healthcare，英國），轉(zhuǎn)染試劑、Lipofectamine PLUS reagent（Invtrogen，美國），熒光素發(fā)光檢測試劑盒（Promega，美國），逆轉(zhuǎn)錄 ReverTra Ace-a kit試劑盒（Toyobo，Osaka 日本），Real-time PCR SYBR Green試劑盒（Bio-Rad，美國），空白pGL3熒光素酶報告質(zhì)粒，包含perilipin2啟動子-2 090 bp區(qū)域的pGL3質(zhì)粒，對照pRL-TK質(zhì)粒及PYC由日本九州大學附屬病院第三內(nèi)科生山祥一郎教授慷慨提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理：RAW264.7鼠巨噬細胞株（RIKEN，日本）1×106個接種于10 mLα-MEM培養(yǎng)基中（100 mL/L胎牛血清，1×105U/L青霉素），置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱。1~2 d傳代1次。50μg/mL碧羅芷或DMSO預(yù)處理RAW264.7細胞1 h后，200 μmol/L油酸刺激細胞24h，行Real-timePCR及Westernblot檢測perilipin2mRNA和蛋白的表達水平。

1.2.2 Real-time PCR：按 Isogen說明書提取總RNA。取0.5μg總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄ReverTra Ace-a kit說明書操作合成單鏈cDNA，鼠perilipin2上游引物序列：5′-CTGTCTACCAAGCTCTGCTC-3′，下游引物序列：5′-CGATGCTTCCTTCCACTCC-3′。 GAPDH上游引物序列：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物序列：5′-TCCACCACCCTGTTGCTTA-3′。按SYBER Green Real-time PCR熒光試劑盒說明書操作，總反應(yīng)體積25μL（12.5μLSYBERGreen supermix 5μL，1︰20稀釋的cDNA，各引物的終濃度為320 nmol/L），以GAPDH為內(nèi)參照物，perilipin2量以對GAPDH的相對誘導倍數(shù)表示。

1.2.3 Western blot：用4℃預(yù)冷裂解液（含pH 7.5 50 mmol/L Tris-HCl，0.5 g/L Nonidet 40、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA、150 mmol/L NaC1、100 mL/L甘油、50 mmol/L氟化鈉、10 mmol/L焦磷酸鈉、1 mmol/L礬酸鈉、80μmol/Lβ甘油磷酸、1 mmol/L PMSF、10 mg/Laprotinin、100 mg/L soybean trypsin inhibitor和10 mg/L leupeptin）裂解細胞。取25μg蛋白，95℃變性5 min后，經(jīng)120 g/LSDS2PAGE行垂直電泳（100 V×90 min），室溫100 V ×100 min轉(zhuǎn)膜，50 g/L牛奶室溫封閉1 h。結(jié)合一抗（豚鼠抗鼠ADRPmAb，1∶200 稀釋），室溫 1 h，結(jié)合二抗（羊抗豚鼠，1∶20 000 稀釋），室溫 1 h。感光、洗片，蛋白條帶掃描后行光密度分析。

1.2.4 瞬時轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性分析：用Lipofectamine PLUSreagent轉(zhuǎn)染試劑，按使用說明書進行操作，將 RAW264.7細胞（2×105/孔）接種于 12孔板，培養(yǎng)24 h后，改為去除胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染混合液 50μL（Lipofectamine 2μL，PLUSreagent 5 μL，1μg熒光素酶報告質(zhì)粒，0.4μg pRL-TK 質(zhì)粒，用去除胎牛血清培養(yǎng)液調(diào)整至50μL），37℃轉(zhuǎn)染4 h。1×PBS洗滌，改為包含胎牛血清α-MEM培養(yǎng)基，PYC預(yù)處理1 h后，用相應(yīng)濃度油酸培養(yǎng)24 h。收集并裂解細胞，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System熒光素酶檢測系統(tǒng)，按說明書操作，進行熒光素酶活性檢測。根據(jù)對照質(zhì)粒pRL-TK Renilla活性標準化轉(zhuǎn)染效率。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SSPS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)用x±s表示，采用單因素方差分析（ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 油酸誘導巨噬細胞perilipin2 mRNA和蛋白的表達

圖1 油酸以濃度依賴方式上調(diào)RAW264.7細胞perilipin2 mRNA和蛋白的表達Fig.1 Oleic acid stimulated perilinpin2 expression in a dosedependent manner in RAW 264.7 cells

長鏈游離脂肪酸可誘導perilipin2表達，因此我們首先檢測了長鏈游離脂肪酸的代表—油酸對鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞perilipn2表達的影響。結(jié)果提示，油酸以劑量依賴的方式顯著誘導了perilipin2 mRNA和蛋白的表達（圖1）。由于200 μmol/L油酸對perilipin2 mRNA和蛋白表達的誘導作用最顯著且未見任何毒性作用，因此我們選用濃度200μmol/L進行下一步研究。結(jié)果顯示，200 μmol/L油酸以時間依賴的方式顯著誘導了perilipin2 mRNA和蛋白的表達（圖2），刺激24 h時誘導效果最顯著。

圖2 油酸以時間依賴方式上調(diào)RAW264.7細胞perilipin2 mRNA和蛋白的表達Fig.2 Oleic acid stimulated perilinpin2 expression in a timedependent manner in RAW 264.7 cells

2.2 PYC抑制油酸誘導的perilipin2表達

我們的前期研究證明，肝細胞中PYC可下調(diào)perilipin2的表達，從而抑制脂質(zhì)在肝細胞的聚集［4］。因此，本研究中我們檢測了PYC對巨噬細胞中perilipin2表達的影響。結(jié)果表明，PYC以劑量依賴方式顯著抑制了油酸誘導的perilipin2 mRNA和蛋白的表達。50μg/mLPYC幾乎完全抑制了油酸誘導的perilipin2表達（圖3）。

2.3 PYC抑制油酸誘導的perilipin2啟動子的活性

圖3 PYC抑制油酸誘導的perilipin2表達Fig.3 PYC suppressed OA-induced perilipin2 expression

我們在前期研究中構(gòu)建了包含perilipn2基因5′端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)-2 090 bp的熒光素酶報告質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)染至RAW264.7細胞，通過熒光素酶活性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，油酸顯著誘導了perilipin2啟動子的活性，使其升高了4.5倍（圖4）。下一步我們檢測了PYC是否可以抑制油酸誘導的啟動子活性。轉(zhuǎn)染包含perilipin2啟動子區(qū)域-2 090 bp pGL3熒光素酶表達質(zhì)粒至RAW264.7細胞，50μg/mL PYC預(yù)處理1 h后，用油酸連續(xù)刺激24 h。熒光素酶活性分析結(jié)果顯示，PYC顯著抑制了油酸誘導的啟動子活性（圖4）。提示PYC通過抑制油酸誘導的perilipin2啟動子的活性而抑制了perilipin2的表達。

圖4 PYC抑制油酸誘導的perilipin2啟動子活性Fig.4 PYCsuppressed OA-induced perilipin2 promoter activity

3 討論

研究表明，PAT（perilipin，adipophilin，Tip47）家族蛋白鑲嵌在細胞內(nèi)脂肪滴表面，調(diào)控脂肪滴和脂質(zhì)的生成、轉(zhuǎn)運、聚集和脂肪分解。PAT家族蛋白包括 ：perilipin，adipose differentiation-related protein（ADRP），tail-interacting protein of 47 kDa（TIP47），現(xiàn)重新命名為 perilipin1，perilipin2 和 perilipin3［5，6］。其中perilipin2在巨噬細胞、泡沫細胞及動脈硬化斑塊中選擇性高表達，提示perilipin2表達與動脈粥樣硬化形成密切相關(guān)［7，8］。長鏈游離脂肪酸、oxLDL、VLDL、PPAR配體及 TRL4，9信號通路均可上調(diào)perilipin2 的表達［6，9，10］。由于長鏈脂肪酸是過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）的配體，并通過激活PPAR來發(fā)揮其生物學作用，在人和鼠的perilipin2啟動子上游均存在PPAR反應(yīng)原件（PPRE），因此，我們推測長鏈脂肪酸是通過激活PPAR誘導perilipin2表達的［4，11，12］。本研究選用油酸作為長鏈脂肪酸的代表誘導perilipin2的表達，結(jié)果表明，在鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞中，油酸以劑量和濃度依賴方式顯著誘導了perilipin2 mRNA和蛋白的表達，濃度為200μmol/L時誘導作用最顯著。接下來我們構(gòu)建了包含PPRE的perilipin2啟動子區(qū)域-2 090 bp的pGL3熒光素酶報告質(zhì)粒。熒光素酶活性分析實驗結(jié)果顯示，油酸顯著誘導了perilipin2啟動子的活性，提示油酸通過激活PPAR誘導了perilipin2的表達。

研究顯示，perilipin2過表達增加了人單核細胞系THP-1源性巨噬細胞的脂質(zhì)蓄積，在誘導THP-1細胞向巨噬細胞分化的過程中或用氧化修飾的低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白刺激THP-1源性巨噬細胞時，perilipin2的表達均上調(diào)［7］。另外，perilipin2在人動脈粥樣硬化斑塊和斑塊內(nèi)的泡沫細胞中也高度表達［8］。最近關(guān)于perilipin2和ApoE雙基因敲除鼠的研究表明，perilipin2基因的敲除抑制了泡沫細胞形成及動脈粥樣硬化的病變進展［3］。這些研究結(jié)果提示，perillipin2在巨噬細胞中的高表達與泡沫細胞形成和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抑制perilipin2的表達有助于延緩動脈粥樣硬化進展。

PYC是法國海岸松樹皮提取物，目前作為健康食品和化妝品成分已在包括中國在內(nèi)的40多個國家上市。PYC由低聚原花青素、果酸及生物類黃酮等40多種小分子水溶性生物活性成分組成，是最強的天然抗氧化劑。研究表明，PYC具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，降低2型糖尿病患者血糖、血脂，改善微循環(huán)的作用［13~16］。本研究結(jié)果首次證明，PYC以濃度依賴方式顯著抑制了油酸誘導的鼠巨噬細胞perilipin2 mRNA和蛋白的表達，并可能因此抑制泡沫細胞的形成。為進一步明確其機制，我們檢測了PYC對perilipin2啟動子活性的影響。結(jié)果表明，PYC以濃度依賴方式抑制油酸誘導的perilipin2啟動子活性，提示PYC是通過抑制PPAR活性而抑制啟動子活性的。鑒于PPAR在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過程中的復(fù)合作用，我們有理由相信抑制PPAR活性有可能是PYC調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝異常的基本分子機制。

總之，本研究證明了在巨噬細胞中PYC抑制了油酸誘導的perilipin2表達，并進一步揭示PYC是通過抑制perilipin2啟動子活性而直接抑制perilipin2表達的，為將來PYC應(yīng)用于動脈粥樣硬化的防治提供了理論支持。

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