郭艷，尚超，孫開來，鐘鳴，富偉能

（中國醫(yī)科大學1.口腔醫(yī)學院中心實驗室，沈陽 110002；2.基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學教研室，沈陽 110001）

喉癌是原發(fā)于上皮的最常見的頭頸部惡性腫瘤，其中絕大多數(shù)組織類型是鱗狀細胞癌（laryngeal squamouscell carcinoma，LSCC）。盡管科研工作者從多個層面致力于喉鱗癌的研究，但其生存率和治療策略一直沒有顯著的提高。近年來，微小RNA（microRNAs，miRNAs）的發(fā)現(xiàn)為腫瘤治療靶點的研究帶來了新的曙光，它是一類長約22個核苷酸的非編碼小RNA，通過降解靶基因mRNA或抑制其翻譯而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著類似于癌基因和抑癌基因的功能［1］。Li等［2］應用 miRNAs芯片建立LSCCmiRNAs表達譜，發(fā)現(xiàn)微小RNA-24（microRNA-24，miR-24）表達水平顯著低于癌旁組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，提示miR-24在LSCC發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著抑癌基因的功能。因此，本研究中我們將以LSCCHep2細胞系為研究對象，體外生物合成miR-24前體（pre-miR-24），通過轉(zhuǎn)染、MTT 和 Transwell小室法進一步探討miR-24對LSCC細胞增殖、侵襲能力的影響，以期為miR-24介導的LSCC分子機制研究乃至LSCC有效分子靶標的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人LSCCHep2細胞系和鼠NIH3T3細胞系由本室保存，常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco）中，取對數(shù)生長期的細胞用于后繼實驗。

1.2 miR-24前體合成與細胞轉(zhuǎn)染

miRNA-24前體（pre-miR-24）由 Ambion公司合成，cotrol miR為陰性對照。Hep2細胞于轉(zhuǎn)染前24 h接種于 24孔板中（4×104/孔），按照脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000操作說明將50 nmol/L pre-miR-24和control miR分別轉(zhuǎn)入Hep2細胞中，單獨轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體組為空白對照。37℃5%CO2培養(yǎng)箱中重新培養(yǎng)后進行相關檢測。

1.3 熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效果

用mirVana miRNA分離試劑盒（Ambion）提取總miRNA。QuantiMir反轉(zhuǎn)錄試劑盒（System Biosciences）逆轉(zhuǎn)錄成小RNA的cDNA。根據(jù)操作說明應用SYBR熒光染料（Ambion）檢測pre-miR-24的表達，U6-snRNA為內(nèi)參。miR-24特異性上游引物為：5′-TGGCTCAGTTCAGCAGGAACAG-3′，通用下游引物為：5′-CGAATTCTAGAGCTCGAGGCAGGCGACATGGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCT CGGATCCACTAGTCC（T）25VN-3′。反應體系為 30 μL，反應條件為：95 ℃ 10 min，然后按 95 ℃ 15 s，60℃1 min進行40個循環(huán)。應用的儀器是ABI公司的7500熒光定量PCR儀，使用的軟件是7500 Software V2.0.5。3次獨立樣本經(jīng)過3次獨立實驗后得到的數(shù)據(jù)通過比較 CT 值法（2－ΔΔCT）進行相對定量分析。

1.4 相差顯微鏡下觀察細胞生長情況

Pre-miR-24轉(zhuǎn)染Hep2細胞36 h后，分別在相差顯微鏡下觀察各組細胞的生長情況并拍攝照片。

1.5 細胞增殖檢測

Hep2細胞轉(zhuǎn)染pre-miR-24及其對照control miR 1、3、5、7 d 后，細胞增殖檢測同參考文獻［3］。

1.6 體外細胞侵襲能力檢測

［3］。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有實驗重復3次，應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗，結(jié)果表示為x±s，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR驗證轉(zhuǎn)染效果

為了確定pre-miR-24是否已經(jīng)成功導入Hep2細胞中，我們在轉(zhuǎn)染36 h后，用熒光定量PCR相對定量的方法檢測了miR-24的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染36 h時，pre-miR-24轉(zhuǎn)染組中miR-24的表達較對照組明顯升高（圖1A、1B），該結(jié)果表明瞬時轉(zhuǎn)染成功，后繼實驗可以采用pre-miR-24轉(zhuǎn)染36 h的細胞進行分析。

圖1 熒光定量PCR檢測miR-24表達結(jié)果。Fig.1 Result of miR-24 expression assayed by real-time quantitative PCR

2.2 miR-24抑制LSCCHep2細胞增殖

為了了解miR-24在LSCC Hep2細胞中的作用，我們在Hep2細胞中轉(zhuǎn)染pre-miR-24 36 h后，通過相差顯微鏡觀察pre-miR-24對Hep2細胞形態(tài)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pre-miR-24組Hep2細胞明顯變圓、細胞數(shù)量明顯減少（圖2A-2C），提示pre-miR-24能抑制Hep2細胞的生長；同樣MTT實驗表明，與轉(zhuǎn)染control組相比，pre-miR-24轉(zhuǎn)染組Hep2細胞增殖能力顯著降低（圖2D），進一步證實了miR-24具有抑制Hep2細胞增殖的能力。

2.3 miR-24降低LSCCHep2細胞體外侵襲能力

Hep2細胞轉(zhuǎn)染pre-miR-24 36h后，通過Transwell小室侵襲實驗觀察各組細胞侵襲能力的變化，結(jié)果顯示pre-miR-24轉(zhuǎn)染組的跨膜細胞數(shù)為（12.37±0.52），明顯低于control miR轉(zhuǎn)染組和空白對照組的跨膜細胞數(shù)［（32.48±0.95）；（34±1.25）］，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示miR-24具有抑制Hep2細胞侵襲的作用。

圖2 miR-24對Hep2細胞增殖能力的影響Fig.2 Effects of miR-24 on Hep2 cell proliferation

3 討論

miRNAs是一種廣泛存在的對基因表達進行轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的分子，具有控制基因表達及細胞增殖、分化和凋亡等多種功能，幾乎在所有腫瘤的發(fā)生或發(fā)展過程中均可檢測到miRNAs的過表達或表達缺失，而且這些異常表達的miRNAs通常超過半數(shù)定位于癌基因或抑癌基因的相關遺傳區(qū)域，從而表現(xiàn)出類似癌基因或抑癌基因的作用［4，5］。研究表明，miR-24定位于染色體的EST區(qū)域，且該區(qū)域為染色體上的不穩(wěn)定區(qū)域，在頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）中經(jīng)常發(fā)生改變［6］。

關于miR-24異常表達與腫瘤生物學行為的關系目前仍然存在爭議。有的學者認為miR-24在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著類似于腫瘤抑制基因的功能，而有的學者認為miR-24發(fā)揮著癌基因的作用。如在宮頸癌Hela細胞中，miR-24表達下調(diào)，細胞增殖能力明顯增強；在肺癌A549細胞中，miR-24表達下調(diào)導致細胞生長水平的下調(diào)［7］。盡管2種觀點存在矛盾之處，但2者一致性認為miR-24在腫瘤中發(fā)揮重要的功能，并且目前尚沒有關于miR-24與LSCC發(fā)生、發(fā)展及生物學功能的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，通過體外人為的上調(diào)miR-24的表達能明顯改變Hep2細胞形態(tài)，使細胞數(shù)量明顯減少，細胞的增殖和侵襲能力明顯降低，證實miR-24能夠減慢LSCC的發(fā)展速度，抑制LSCC的細胞增殖和侵襲能力。另外，由于miRNAs在血液中穩(wěn)定性很好，而且輕微的miRNAs表達降低即可在患者外周血中檢測到很高水平的miRNAs表達變化［8］，并且血液標本的采集損傷性小，進一步揭示血液中miR-24的表達變化亦可能成為臨床上極具價值的非侵入性LSCC診斷材料之一。

但為什么miR-24在不同組織類型中的表達不一樣，并且發(fā)揮的作用也不盡相同，甚至完全相反呢？我們推測這一現(xiàn)象的主要原因在于不同類型細胞中的miR-24調(diào)控的靶基因存在差異，導致參與的細胞信號轉(zhuǎn)導通路差異，進而對細胞生長、增殖等生物學活性產(chǎn)生不同的調(diào)控效應。因此，在未來的研究中，我們將分析LSCC中miR-24的靶基因，進一步探討miR-24抑制細胞增殖和侵襲的分子機制。

參考文獻：

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［3］郭艷，富偉能，尚超，等.HLA-B對喉癌Hep2細胞生物學行為的影響［J］.山東醫(yī)藥，2011，51（11）：21-22，33.

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