代政偉，張華，孟濤，晏寧，李潔穎，晏勇

（重慶醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2.附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶400010）

β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1） 是淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）產(chǎn)生 β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）的限速酶［1］，其活性或表達(dá)增加是阿爾茨海默?。ˋlzheimer’sdisease，AD）發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，因此對(duì)BACE1的調(diào)節(jié)干預(yù)成為AD治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。近來發(fā)現(xiàn)，生理濃度下的硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）能夠激活包括磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol-3 kinase/serine threonine kinase，PI3-K/Akt）及絲裂酶原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1/2（mitogen-activated protein kinase/extracellular singal-regulated kinase 1/2，MAPK/ERK1/2） 在內(nèi)的多種信號(hào)通路，發(fā)揮廣泛的調(diào)節(jié)功能［2］，而AD患者腦及血漿中內(nèi)源性H2S含量明顯降低［3］，且降低的水平與患者病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［4］，表明H2S減少與AD發(fā)病有著密切的關(guān)聯(lián)。但是，H2S與BACE1的關(guān)系目前尚未見報(bào)道。因此，本文旨在探討外源性H2S對(duì)BACE1表達(dá)的影響及可能涉及的細(xì)胞信號(hào)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤（PC12）細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、NGF（GIBCO公司）；NaHS（Sigma公司）；RT-PCR試劑盒［寶生物（大連）有限公司］；BACE1抗體（Merck公司）；小鼠抗Akt1、兔抗大鼠Ser473位點(diǎn)磷酸化Akt1/2/3（pAkt1/2/3）、ERK1/2、Thr202 位點(diǎn)磷酸化 ERK1/2（pERK1/2）抗體（Santa Cruz公司）；PI3-K 抑制劑 LY294002、MEK抑制劑PD98059（Cayman Chemical公司）；大鼠Aβ42酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

PC12細(xì)胞株接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清，100 IU/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代24 h后換液，加入終濃度為50 ng/mL的NGF，誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞分化，3周左右至完全，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、NaHS 組 （NaHS 50、100、200 μmol/L組）、LY294002預(yù)處理組（LY 25μmol/L+NaHS 200 μmol/L、LY 50 μmol/L+NaHS 200 μmol/L組）和PD98059預(yù)處理組（PD 25μmol/L+NaHS 200 μmol/L、PD 50μmol/L+NaHS200μmol/L組）。處理時(shí)吸棄舊培養(yǎng)基，洗滌后加入不含胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，并分別加入終濃度為分組劑量濃度的NaHS或通路抑制劑，預(yù)處理組抑制劑先于NaHS30 min加入。處理完成的各組細(xì)胞在相同培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h后，分別收獲細(xì)胞及培養(yǎng)液用于指標(biāo)檢測(cè)，完全重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3 RT-PCR檢測(cè)BACE1 mRNA的表達(dá)

按試劑說明書操作步驟抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì) BACE1及 β-actin引物，由上海生工科技公司合成。BACE1上游引物：5′TTTCCCAGTCATTTCACTTTAC 3′， 下 游 引 物 ：5′GCCGTCCTGAACTCATCG 3′。β-actin 上游引物：5′CCACTGCCGCATCCTCTT 3′，下游引物：5′GGACTCATCGTACTCCTGCT 3′。BACE1 PCR反應(yīng)條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。BACE1與β-actin終產(chǎn)物片段長(zhǎng)度分別為267 bp和413 bp，行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像，光密度分析，計(jì)算BACE1/β-actin光密度比值為目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 Western blot檢測(cè) BACE1、pAkt、pERK1/2 蛋白的表達(dá)

PBS洗滌細(xì)胞2次，加入全蛋白提取液及PMSF緩沖液，冰浴裂解細(xì)胞，提取蛋白，BCA法定量。取樣品25μg行SDS-PAGE電泳，將凝膠中蛋白濕法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉TBST液封閉。分別加入兔多抗 BACE1（1∶250）、pAkt1/2/3（1∶500）、ERK1/2（1∶250）、pERK1/2（1∶300）抗體和小鼠抗 Akt1（1∶250）、β-actin 單抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，洗滌后孵育二抗（羊抗兔和羊抗小鼠抗體1∶2 000）。ECL試劑發(fā)光顯影成像，X線片拍照保存。光片置于凝膠成像系統(tǒng)白光下掃描，蛋白的相對(duì)表達(dá) 水 平 分 別 用 BACE1/β-actin、pAkt1/Akt1 和（pERK1/2）/（ERK1/2）的光密度比值來表示。

1.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中Aβ42水平的變化

離心并取細(xì)胞培養(yǎng)液上清。室溫下配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液、洗滌液、TMB底物溶液以及反應(yīng)終止液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔和空白孔，按試劑盒說明書操作步驟加液、甩干、洗滌及孵育。TMB底物溶液，37℃避光顯色。適時(shí)終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)量光密度值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度與光密度對(duì)數(shù)值為坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，各組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的外源性H2S對(duì)BACE1表達(dá)的影響（圖 1）

圖1 不同濃度NaHS對(duì)BACE1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of NaHS on the expressions of BACE1 mRNA and protein

RT-PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組內(nèi)有自發(fā)的BACE1 mRNA表達(dá)（1.059±0.114），各NaHS組其表達(dá)隨NaHS濃度增加而減少［分別為（0.850±0.096）、（0.517±0.060）和（0.303±0.065）］，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.523，P=0.000），且各 NaHS 組分別與對(duì)照組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為t=2.947，P=0.019；t=7.669，P=0.000；t=10.689，P=0.000）；Western blot結(jié)果與PCR相似，自對(duì)照組至各NaHS組蛋白表達(dá)依次下調(diào)［分別為（0.999±0.041）、（0.638±0.085）、（0.404±0.071）、（0.251±0.054）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=75.446，P=0.000），各 NaHS 組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別t=6.820、11.235、14.109，均 P=0.000）。

2.2 LY294002對(duì)外源性H2S誘導(dǎo)的PI3-K/Akt通路下游蛋白Akt1磷酸化的影響及BACE1表達(dá)變化的調(diào)節(jié)（圖2）

圖2 pAkt1蛋白在各細(xì)胞組中的表達(dá)及LY294002對(duì)NaHS誘導(dǎo)的BACE1表達(dá)變化的影響Fig.2 Expression of pAkt1 protein in different groups and the effect of LY294002 on the change in BACE1 expression induced by NaHS

Western blot結(jié)果顯示，NaHS 200μmol/L組pAkt1蛋白表達(dá)上調(diào)（1.398±0.100），較對(duì)照組（0.780±0.053）有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=11.267，P=0.000）；與NaHS 200μmol/L組相比，LY294002預(yù)處理組NaHS誘導(dǎo)的Akt1磷酸化被不同程度抑制，pAkt1表達(dá)隨抑制劑濃度增加而降低［分別為（0.986±0.565）和（0.571±0.045）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=100.845，P=0.000；t=7.074，P=0.000；t=14.202，P=0.000）；而 200 μmol/L NaHS下調(diào)BACE1的作用被削弱，BACE1蛋白表達(dá)［分別為（0.759±0.070）和（0.976±0.113）］較 NaHS 200μmol/L 組（0.257±0.064）上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=56.277，P=0.000；t=7.214，P=0.000；t=10.344，P=0.000）。

2.3 PD98059對(duì)外源性H2S誘導(dǎo)的MAPK/ERK1/2通路下游蛋白ERK1/2磷酸化的影響及BACE1表達(dá)變化的調(diào)節(jié)（圖3）

圖3 Western blot法檢測(cè)pERK1/2蛋白在各細(xì)胞組中的表達(dá)及PD98059對(duì)NaHS誘導(dǎo)的BACE1表達(dá)變化的影響Fig.3 Expression of pERK1/2 protein in different groups and the effect of PD98059 on the change in BACE1 expression induced by NaHS

Western blot結(jié)果顯示，NaHS 200μmol/L組pERK1/2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào)［分別為（1.554±0.107）和（0.917±0.092）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.053，P=0.000）；PD98059 預(yù)處理組中 NaHS 誘導(dǎo)的pERK1/2表達(dá)上調(diào)被抑制，且pERK1/2表達(dá)隨PD98059濃度增加而下降［分別為（0.990±0.088）和（0.693±0.045）］，與 NaHS 200μmol/L 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=80.970，P=0.000；t=8.204，P=0.000；t=12.527，P=0.000）；但 PD98059 預(yù)處理未能削弱NaHS下調(diào)BACE1的作用，預(yù)處理組［分別為（0.259±0.086）和（0.280±0.106）］與 NaHS200 μmol/L組（0.266±0.064）比較，BACE1水平無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.047，P=0.954；t=0.190，P=0.855；t=0.114，P=0.913）。

2.4 外源性 H2S對(duì) Aβ42蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)及LY294002和PD98059對(duì)其影響（圖4）

圖4 各細(xì)胞組Aβ42蛋白表達(dá)的ELISA結(jié)果Fig.4 Expression of Aβ42 protein in different groups detected by ELISA

ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組（36.812±2.480）相比，各NaHS處理組培養(yǎng)液中Aβ42表達(dá)水平隨NaHS濃度增加依次下調(diào)［分別為（28.409±1.337）、（21.537±2.964）和（13.313±3.664）］，在 LY294002 預(yù)處理組，Aβ42表達(dá)又增加至 23.040±4.001和 35.682±1.205，在 PD98059預(yù)處理組，Aβ42表達(dá)仍在較低的水平［分別為（13.394±3.051）和（14.214±4.633）］，其中各NaHS處理組與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=39.768，P=0.000；t=3.749，P=0.006；t=6.815，P=0.000；t=10.483，P=0.000），LY294002 預(yù)處理組與NaHS 200μmol/L組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=36.572，P=0.000；t=3.709，P=0.010；t=8.528，P=0.000），而PD98059預(yù)處理組與NaHS200 μmol/L組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.051，P=0.951；t=0.026，P=0.980；t=0.288，P=0.783）。

3 討論

Aβ沉積形成老年斑是AD最主要的病理改變，其產(chǎn)生的神經(jīng)毒性作用可導(dǎo)致AD發(fā)病。研究發(fā)現(xiàn)，淀粉樣蛋白斑塊周圍的神經(jīng)元內(nèi)BACE1水平增高［5］，而BACE1基因缺失可以減少Aβ的產(chǎn)生及沉積，挽救認(rèn)知和海馬膽堿能神經(jīng)功能障礙［6］，所以大部分學(xué)者認(rèn)為BACE1在Aβ生成中扮演著關(guān)鍵性角色，是AD病理過程的重要因素。作為繼NO、CO之后第3種氣體信號(hào)分子，H2S對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)十分重要，其濃度過高可導(dǎo)致機(jī)體中毒，過低也可能引起疾病的發(fā)生與進(jìn)展。H2S參與AD發(fā)病的可能機(jī)制目前認(rèn)為主要與血清H2S水平降低影響海馬長(zhǎng)時(shí)程形成及突觸活動(dòng)而損害學(xué)習(xí)和記憶，H2S減少影響其抗氧化的神經(jīng)保護(hù)作用以及H2S減少引起的腦血管張力增加致使腦組織長(zhǎng)期慢性缺血等原因有關(guān)［6］。但H2S水平的改變能否影響B(tài)ACE1表達(dá)進(jìn)而參與AD病理過程尚不清楚，所以我們對(duì)此進(jìn)行了研究。

據(jù)報(bào)道，NaHS在溶液中解離可提供原始濃度33%左右的H2S，較直接泵入H2S氣體更穩(wěn)定，因此我們采用NaHS作為外源性H2S的供體取代直接泵入H2S。選取PC12細(xì)胞作為研究對(duì)象，是因其被NGF誘導(dǎo)分化后具有神經(jīng)細(xì)胞特性，又可穩(wěn)定傳代，是國(guó)際上公認(rèn)的體外研究神經(jīng)生物、化學(xué)及神經(jīng)疾病的理想模型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50～200μmol/L NaHS處理PC12細(xì)胞，從基因與蛋白水平上呈劑量依賴性下調(diào)BACE1的表達(dá)。因此我們認(rèn)為，實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的NaHS釋放的H2S因遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于哺乳動(dòng)物腦內(nèi)H2S的生理濃度（50～160μmol/L）上限，對(duì)PC12細(xì)胞沒有毒性，卻有抑制BACE1表達(dá)的作用。腦和血漿中內(nèi)源性H2S降低的AD患者病理效應(yīng)的產(chǎn)生可能與BACE1表達(dá)增加有關(guān)。

PI3-K/Akt與MAPK/ERK1/2通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其下游關(guān)鍵蛋白Akt及ERK1/2磷酸化增加時(shí)，通路被激活。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)pAkt水平降低與AD有必然的聯(lián)系［7］，而MAPK/ERK1/2通路的激活也從多方面參與了學(xué)習(xí)、記憶的形成過程［8］。因此，為了進(jìn)一步探討H2S調(diào)節(jié)BACE1的細(xì)胞信號(hào)機(jī)制，我們分別用不同濃度的特異性抑制劑預(yù)先阻斷上述2條通路，然后與200μmol/L NaHS共同培養(yǎng)細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純的NaHS處理使pAkt1、pERK1/2表達(dá)上調(diào)，同時(shí)BACE1表達(dá)下降，阻斷PI3-K/Akt通路使NaHS的這種作用被削弱，而阻斷MAPK/ERK1/2通路其表達(dá)無明顯變化。因此，我們推測(cè)外源性H2S調(diào)節(jié)PC12細(xì)胞BACE1的表達(dá)可能是通過PI3-K/Akt通路及其下游信號(hào)蛋白的激活實(shí)現(xiàn)的，與MAPK/ERK1/2通路激活無關(guān)。我們的前期研究結(jié)果顯示，PI3-K/Akt信號(hào)通路受損明顯上調(diào)BACE1表達(dá)［9］，也支持我們的推測(cè)。有學(xué)者在采用NT2細(xì)胞研究MAPK/ERK1/2通路對(duì)BACE1的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，通路有負(fù)性調(diào)節(jié)BACE1活性與表達(dá)的作用［10］，與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，這是否與不同細(xì)胞系內(nèi)活化的pERK1/2出現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)或其在細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的定位聚集不同而失作用于下游目的蛋白有關(guān)，仍需結(jié)合其它可能因素做進(jìn)一步分析。

Aβ是APP經(jīng)BACE1裂解途徑代謝的終產(chǎn)物，腦內(nèi)有病理意義的 Aβ 包括 Aβ40和 Aβ42，Aβ40水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Aβ42，但后者更易沉積，是形成老年斑的主要成分，故我們對(duì)Aβ42進(jìn)行了檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)NaHS同樣下調(diào)了Aβ42表達(dá)，并且這種作用被阻斷PI3-K/Akt通路所拮抗，而與阻斷MAPK/ERK1/2通路無關(guān)。一般認(rèn)為，Aβ的神經(jīng)毒性主要是通過氧化應(yīng)激引起的，但氧化應(yīng)激本身又會(huì)促進(jìn)Aβ的產(chǎn)生、聚集和沉積，有研究指出，H2S能對(duì)抗谷氨酸［11］和HOCL［12］引起的氧化應(yīng)激，所以基于上述理論我們有理由認(rèn)為，外源性H2S可能正是通過其抗Aβ產(chǎn)生的氧化應(yīng)激作用負(fù)性調(diào)節(jié)BACE1表達(dá)進(jìn)而反饋下調(diào)Aβ的，但目前尚難定論。然而本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用外源性H2S從病理起源上減少了Aβ的產(chǎn)生，為AD的臨床治療提供了合理的設(shè)想。

總之，我們的研究表明，外源性H2S具有下調(diào)PC12細(xì)胞BACE1表達(dá)的作用，其信號(hào)機(jī)制可能涉及PI3-K/Akt通路的激活，與MAPK/ERK1/2通路激活無關(guān)。用外源性H2S調(diào)節(jié)BACE1，為臨床上防治AD開辟了新的思路，也為進(jìn)一步研發(fā)具有釋放H2S功效的藥物提供了新的理論依據(jù)。

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