王寧，陳洋，姜奕

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.普通外科；2.中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110001）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道腫瘤，目前認(rèn)為其發(fā)生、發(fā)展經(jīng)歷從正常上皮—增生—腺瘤—癌—浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移這樣一個(gè)過程［1，2］。碳酸酐酶（carbonic anhydrases，CA）是一組催化H++HCO3-葑H2O+CO2可逆反應(yīng)的同工酶。CA家族包括十幾個(gè)成員，其中 CAⅠ、CAⅡ位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)［3，4］。迄今為止關(guān)于CAⅠ、CAⅡ在CRC中表達(dá)情況的報(bào)道不多，它們的表達(dá)與CRC的發(fā)生、發(fā)展以及臨床病理特征的關(guān)系尚有待進(jìn)一步闡明。本研究采用免疫組織化學(xué)法，對(duì)CAⅠ、CAⅡ在正常結(jié)直腸黏膜、息肉、腺癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)進(jìn)行研究，探討CAⅠ、CAⅡ的表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

取自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科2008年3月至2010年9月術(shù)前未經(jīng)放化療、手術(shù)切除的64例原發(fā)性CRC患者標(biāo)本，患者平均年齡（61.4±12.5）歲，其中男33例，女31例。術(shù)后病理證實(shí)64例均為腺癌。術(shù)后病理證實(shí)的20個(gè)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)（lymph node metastasis，LNM）來自 15例腺癌，27個(gè)息肉（包括增生性息肉17個(gè)和腺瘤性息肉10個(gè)）來自上述15例腺癌同時(shí)切除的標(biāo)本。另外3個(gè)腺瘤為結(jié)腸鏡無法電切，經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。55個(gè)配對(duì)的正常黏膜取自CRC患者，距腫瘤10 cm以上肉眼觀察正常處。CRC中高分化18例，中分化33例，低分化13例；TNM分期Ⅰ期4例，Ⅱ期31例，Ⅲ期25例，Ⅳ期4例。

CAⅠ羊抗人多克隆抗體、CAⅡ鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司（PBS稀釋，濃度為1∶100）。三步法免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自福州邁新公司。

1.2 方法

對(duì)以上組織進(jìn)行甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片。其中1張切片行HE染色供病理診斷，其余切片供免疫組織化學(xué)研究。

石蠟切片以二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化。新鮮配制的3%雙氧水，室溫15 min去除內(nèi)源性過氧化酶。用蒸餾水和pH 7.4的PBS緩沖液清洗后，高溫高壓修復(fù)：置于pH 6.0的檸檬酸緩沖液入高壓鍋中加熱至沸騰2 min，PBS緩沖液沖洗。滴加動(dòng)物非免疫血清，室溫封閉1 h，滴加一抗，4℃孵育過夜。用PBS沖洗后，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫下反應(yīng)20 min。再用PBS沖洗。滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，室溫下反應(yīng)20 min，PBS沖洗，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染或輕染。自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，依信號(hào)的強(qiáng)弱分為陰性（-）0分，弱陽(yáng)性（+）1分，中度陽(yáng)性（++）2分，強(qiáng)陽(yáng)性（+++）3分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以x±s表示，采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)有配對(duì)標(biāo)本者進(jìn)行配對(duì)秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

CAⅠ、CAⅡ于胞質(zhì)內(nèi)著色，正常黏膜主要著色區(qū)位于腸腔側(cè)的腺細(xì)胞，而癌組織則無此特點(diǎn)。CAⅠ、CAⅡ信號(hào)在正常黏膜中最強(qiáng)，在增生和腺瘤性息肉減弱，CRC 中最弱（圖 1，2）。

圖1 CAⅠ在正常黏膜、腺瘤、腺癌及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中表達(dá) ×200Fig.1 The expression of CAⅠ in normal mucosa，adenoma，cancer and LNM（Stained with diaminobenzidine and counterstained with hematoxylin，×200）

圖2 CAⅡ在正常黏膜、腺瘤、腺癌及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中表達(dá) ×200Fig.2 The expression of CAⅡ in normal mucosa，adenoma，cancer and LNM （Stained with diaminobenzidine and counterstained with hematoxylin，×200）

CAⅠ強(qiáng)度在配對(duì)的正常黏膜、癌組織中分別為（2.95±0.23）和（1.64±0.52），二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。CAⅠ在增生性息肉和腺瘤性息肉中分別為（2.39±0.50）和（2.44±0.53），與配對(duì)的正常黏膜比較顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CAⅠ在CRC中強(qiáng)度與匹配的息肉（2.41±0.50）比較顯著降低（P＜0.01）。然而，CAⅠ在配對(duì)的CRC和LNM 中表達(dá)強(qiáng)度相近，分別為（1.86±0.36）和（1.67±0.58），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.10）。高、中、低分化的 CRC 中 CAⅠ表達(dá)分別為（1.84±0.50）和（1.63±0.50）、（1.57±0.51），雖逐漸降低但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.21）。在CRC的Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期中CAⅠ表達(dá)分別為（1.63±0.56）、（1.76±0.44），二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.33）。

CAⅡ表達(dá)在配對(duì)的正常黏膜、癌組織中分別為（2.80±0.49）和（1.20±0.87），二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。CAⅡ表達(dá)在增生性息肉和腺瘤性息肉中分別為（2.59±0.51）、（2.50±0.53），與配對(duì)的正常黏膜比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而增生性息肉與腺瘤性息肉間CAⅡ表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.66）。CAⅡ在CRC中表達(dá)與匹配的息肉（2.56±0.51）比較顯著降低（P＜0.01）。然而，CAⅡ表達(dá)在配對(duì)的CRC和LNM（1.35±0.67）中強(qiáng)度相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.61）。高、中、低分化的CRC 中 CAⅠ表達(dá)分別為（1.34±0.91）、（1.17±0.90）、（0.96±0.63），雖逐漸降低但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.60）。在CRC的Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期中CAⅠ表達(dá)分別為（1.32±0.80）、（0.98±0.87），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.91）。

3 討論

CA是一組含鋅的金屬酶，負(fù)責(zé)催化H++HCO3-葑H2O+CO2可逆反應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)酸堿平衡等的調(diào)節(jié)。據(jù)報(bào)道CAⅡ是CA家族中活性最高的，而CAⅠ的活性則為中等［3~5］。

由于CO2很容易被動(dòng)彌散通過細(xì)胞膜，因此細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的CAⅠ、CAⅡ在正常情況下主要是使反應(yīng)向右進(jìn)行，從而幫助CO2的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)［4，6］。雖然腫瘤細(xì)胞外呈酸性（pH 5.6~6.8），但細(xì)胞內(nèi)卻呈中性或堿性（pH 7.2~7.5）［3，7，8］。而 HCO3-是體內(nèi)維持堿性環(huán)境的重要物質(zhì)。因此，我們推測(cè)腫瘤細(xì)胞為了減少HCO3-的丟失，CAⅠ、CAⅡ表達(dá)降低。而來自糖酵解產(chǎn)生的乳酸等的H+則通過Na+/H+交換等主動(dòng)排出細(xì)胞外［4，9］。

Kummola等認(rèn)為，CAⅠ、CAⅡ基因均位于8號(hào)染色體q臂上，而且密切關(guān)聯(lián)。調(diào)控區(qū)域或等位基因的缺失或點(diǎn)突變可導(dǎo)致CAⅠ、CAⅡ的表達(dá)同時(shí)降低。并推測(cè)CAⅠ、CAⅡ可能發(fā)揮著抑癌功能［5］。

CAⅠ、CAⅡ在正常黏膜中的表達(dá)主要在臨近腸腔側(cè)，而且無論在正常結(jié)直腸黏膜組織中還是CRC中CAⅠ、CAⅡ表達(dá)高低與在結(jié)直腸中不同部位無關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［10］。CAⅠ、CAⅡ在正常黏膜中表達(dá)最強(qiáng)，在良性息肉、癌組織中逐級(jí)降低［10］。由于本組CRC中Ⅰ期和Ⅳ期僅各有4例，故我們將Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期分2組比較，并證實(shí)CAⅠ、CAⅡ在CRC中表達(dá)與分期無關(guān)。Kivela等也認(rèn)為CAⅠ、CAⅡ在CRC中表達(dá)與Dukes分期無關(guān)［10］。但Bekku等用Western blot法研究證實(shí)CAⅠ、CAⅡ在CRC中的表達(dá)隨Dukes分期的進(jìn)展顯著降低［11］。與Kivela等的結(jié)果不同［10］，本研究顯示雖然隨著分化程度的降低，CAⅠ、CAⅡ強(qiáng)度減弱，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bekku等［11］的研究表明CAⅠ的表達(dá)與CRC分化無關(guān)；但CAⅡ在結(jié)腸癌中，中分化低于高分化（P＜0.04），在直腸癌中的表達(dá)與分化無關(guān)。而Nieme等對(duì)77個(gè)遺傳性非息肉病性CRC的研究表明CAⅡ的表達(dá)與分化程度和Dukes分期均無關(guān)［12］。

近年關(guān)于CRC的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究也顯示，CAⅠ、CAⅡ是CRC組織中表達(dá)顯著下調(diào)中的兩個(gè)蛋白［13~16］。而且將CAⅡcDNA克隆轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞后，癌細(xì)胞侵襲、趨化運(yùn)動(dòng)能力及耐藥性均明顯降低［13，14］。

本研究與Kivela等的結(jié)果相符，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中CAⅠ、CAⅡ的表達(dá)不再繼續(xù)降低，甚至略高于原發(fā)灶［10］。白雪等的研究也表明，與原發(fā)灶比較，肝轉(zhuǎn)移灶中CAⅡ的表達(dá)并未顯著降低［14］。

綜上所述，CAⅠ、CAⅡ是正常結(jié)直腸黏膜腺上皮細(xì)胞中所必需的酶。CAⅠ、CAⅡ的表達(dá)從增生性息肉和腺瘤開始即顯著低于正常黏膜，說明CAⅠ、CAⅡ表達(dá)下調(diào)是CRC發(fā)生中的早期事件。CAⅠ、CAⅡ在LNM中表達(dá)與原發(fā)灶相比無顯著差異，說明CAⅠ、CAⅡ表達(dá)下調(diào)與LNM無關(guān)。

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