王麗娜，陳永福，岳小強(qiáng)

(第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院中醫(yī)系，上海 200433)

腫瘤的發(fā)生與遺傳、免疫、精神、環(huán)境等多種因素有關(guān)，其中環(huán)境因素在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。原發(fā)性肝癌是嚴(yán)重危害健康和生命的惡性腫瘤之一，其發(fā)病呈現(xiàn)明顯的地域性，高發(fā)地區(qū)具有高熱、潮濕等特性。本實驗?zāi)M寒熱環(huán)境刺激，觀察其對DEN誘發(fā)性大鼠肝癌發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料和方法

1.1 動物

Wistar雄性大鼠，清潔級，中科院上海實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心清潔級動物房。

1.2 主要試劑

二乙基亞硝胺 (diethylnitro samine，DEN)，購自東京化成工業(yè)株式會社;0.9%氯化鈉溶液。大鼠白介素－2(interleukin－2，IL－2)ELISA試劑盒，大鼠白介素－4(interleukin－4，IL－4)試劑盒，大鼠白介素－10(interleukin－10，IL－10)試劑盒，大鼠干擾素－γ(interferon－γ，IFN－γ)ELISA試劑盒，由上海西唐生物科技有限公司進(jìn)口分裝。

1.3 主要儀器

海爾電冰柜，型號:BC/BD－167SC，購自海爾公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)，型號:DHG－9140A，購自上海恒一科技有限公司。

1.4 動物分組及模型制備

Wistar大鼠42只，隨機(jī)分組為4組:肝癌模型 (12只)、熱環(huán)境組 (12只)、寒環(huán)境組 (12只)和空白對照組 (6只)。模型、熱環(huán)境、寒環(huán)境組均按體質(zhì)量10mg/kg給予0.2%DEN灌胃，每日1次，5次/周，至14周末停藥，停藥后自然生長6周，20周后處死動物。模型組在 (22±2)℃環(huán)境下顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，人工照明，光照為12L:12D，相對濕度為50%～80%;熱環(huán)境組置于 (36±2)℃恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)中給予熱刺激3h，1次/日;寒環(huán)境組置于 (0±2)℃冰箱中給予寒刺激3h，1次/日，其余條件同前飼養(yǎng)?？瞻讓φ战M于 (22±2)℃環(huán)境下，其余條件同前飼養(yǎng)，并給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，5次/周，至14周末停止，停藥后，熱環(huán)境、寒環(huán)境組繼續(xù)給予寒熱刺激，20周末處死所有動物。

1.5 肝組織病理學(xué)觀察

HE染色鏡檢，按1987年全國實驗?zāi)[瘤病理專題座談會紀(jì)要所制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理診斷[1]，肝細(xì)胞性肝癌采用Edmonson方法進(jìn)行分級診斷。

1.6 血清IL－2、IL－4、IL－10及IFN－γ檢測

ELISA方法檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS10.0軟件統(tǒng)計系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計處理。計量資料以表示。組間差別采用單因素方差分析，組與組之間比較采用q檢驗，以P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及成瘤率和死亡率的觀察

隨寒熱環(huán)境干預(yù)的進(jìn)行，熱環(huán)境組大鼠逐漸出現(xiàn)煩躁，活動增加，不停抓撓鐵籠，腹部上翻，耳朵、尾巴顏色加深，多汗;寒環(huán)境組大鼠聚集扎堆，身體蜷縮，背毛豎立，耳朵、尾巴顏色變淡;空白對照組和模型組無明顯變化。在造模8周后，除空白對照組外，各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的消瘦、脫毛、爪/毛少光澤等表現(xiàn)，體重下降，熱環(huán)境組體重下降最明顯;各組均有大鼠死亡，模型組死亡2只，熱環(huán)境組死亡4只，寒環(huán)境組死亡2只，均為自然死亡，解剖后見到肝臟紫黑，嚴(yán)重腫脹，布滿顆粒;20周末處死大鼠解剖發(fā)現(xiàn)模型和熱環(huán)境組肝臟重度腫脹，彌漫性肝硬變，滿布大小不等的灰白色結(jié)節(jié)和灰褐色顆粒;寒環(huán)境組肝臟腫脹程度稍輕，質(zhì)軟，散在分布數(shù)個灰白色結(jié)節(jié);空白對照組肝臟外觀正常，表面無結(jié)節(jié)。結(jié)果見表1。

2.2 寒熱環(huán)境對DEN誘發(fā)性肝癌大鼠脾指數(shù)的影響

模型、熱環(huán)境、寒環(huán)境和N組比較，脾臟顯著增大 (P＜0.05);熱環(huán)境組增大最為明顯、寒環(huán)境組增大幅度較小，并小于模型組，熱環(huán)境、寒環(huán)境兩組差異顯著 (P＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠體重與死亡率、成瘤率 ()

表1 各組大鼠體重與死亡率、成瘤率 ()

與正常組比較，*P＜0.05;與熱環(huán)境組比較，△P＜0.05。

/%空白對照組組別 n 體重/g 死亡率/% 成瘤率6 431.17±19.79 0 0模型組 12 317.60±46.62* 16.67 83.3*熱環(huán)境組 12 305.75±14.55* 33.33 91.7*寒環(huán)境組 12329.90±35.26＊△ 16.67 66.7＊△

2.3 寒熱環(huán)境對DEN誘發(fā)性肝癌大鼠肝臟組織學(xué)影響

HE染色顯示，空白對照組肝組織正常表現(xiàn)，經(jīng)DEN染毒后，其余3組大多為肝細(xì)胞性肝癌伴周圍組織肝硬化，少數(shù)為肝硬化，寒環(huán)境組1只大鼠僅為肝纖維化。結(jié)果見圖1。

2.4 寒熱環(huán)境對DEN誘發(fā)性肝癌大鼠Th1、Th2細(xì)胞因子的影響

干預(yù)20周后，ELISA檢測血清細(xì)胞因子，結(jié)果顯示，模型、熱環(huán)境、寒環(huán)境和N組比較，IL－2、IFN－γ呈顯著下降趨勢，其中熱環(huán)境組最低，而在寒環(huán)境中的寒環(huán)境組相對高;IL－4、IL－10則顯著升高，數(shù)值最高的為熱環(huán)境組，而寒環(huán)境組則相對較低，具體數(shù)值見表2。

表2 各組大鼠的血清Th1、Th2細(xì)胞因子的濃度 ()

表2 各組大鼠的血清Th1、Th2細(xì)胞因子的濃度 ()

與正常組比較，*P＜0.05;與熱環(huán)境組比較，△P＜0.05。

組別 IL－2/(pg/mL) IFN－γ/(pg/mL) IL－4/(pg/mL) IL－10/(pg/mL)空白對照組 28.08±8.62 21.53±6.42 6.00±0.99 49.68±17.21模型組 15.17±4.19 6.32±2.14＊△ 10.99±4.91 72.36±10.36＊△熱環(huán)境組 8.59±4.29* 3.38±1.32* 15.29±6.96* 90.38±16.18*寒環(huán)境組 15.49±7.16 8.15±3.17＊△ 7.82±5.51 60.31±13.86△

3 討論

研究已證實，腫瘤的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，其中環(huán)境因素在腫瘤的發(fā)病中起著重要作用，如肝癌的分布具有明顯的地域環(huán)境特征[2]，就世界范圍而言，肝癌高發(fā)的國家和地區(qū)主要分布在亞洲的東南亞和非洲的東南非，在中國主要集中在東南沿海，高發(fā)地區(qū)氣候均具有溫暖、潮濕、多雨的特點[3]。中醫(yī)理論認(rèn)為，外界環(huán)境不但可以影響人的生理、導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病，而且對人的疾病過程也會產(chǎn)生各種的影響。祖國醫(yī)學(xué)將外界環(huán)境分為“風(fēng)寒暑濕燥火”六大類，每一類均是導(dǎo)致疾病發(fā)生的重要原因，且在致病和疾病演變上各有特點。根據(jù)陰陽學(xué)說，又可以把它們進(jìn)一步分為陰陽兩大類，其中寒和熱是陰陽兩類外環(huán)境致病因素的典型代表?；谏鲜稣J(rèn)識，我們以環(huán)境中的寒熱變化 (溫度)為切入點，觀察不同寒熱環(huán)境刺激對DEN誘發(fā)性大鼠肝癌模型腫瘤生物學(xué)特征的影響。在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，設(shè)定了熱環(huán)境溫度36±2℃和寒環(huán)境溫度0±2℃。實驗20周后觀察到，寒熱環(huán)境的兩組與模型組比較，盡管趨勢明顯，但統(tǒng)計差異不顯著;但兩者比較，熱環(huán)境下DEN誘發(fā)性肝癌大鼠的成瘤率和脾指數(shù)明顯要比寒環(huán)境下的高，初步說明長期的寒、熱不同環(huán)境刺激可能會對腫瘤的生成和預(yù)后產(chǎn)生不同的影響。

免疫系統(tǒng)是機(jī)體對抗外來病原體及有效防止腫瘤形成和生長的重要屏障，主要包括細(xì)胞免疫和體液免疫，分別由不同的細(xì)胞及其分泌物介導(dǎo)。其中T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，T淋巴細(xì)胞又分為Th1、Th2兩個功能亞群[4]，以表達(dá)IL－2和 IFN－γ為主的Th1細(xì)胞，可以增強(qiáng)殺傷性效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，主要介導(dǎo)抗腫瘤的細(xì)胞免疫反應(yīng);以表達(dá)IL－4、IL－5、IL－6、IL－10、IL－13為主的Th2型細(xì)胞，促進(jìn)機(jī)體抗體的產(chǎn)生，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，同時也抑制Th1細(xì)胞分泌其系列因子。近年來研究表明[5]，大多數(shù)腫瘤患者和荷瘤動物體內(nèi)Th1細(xì)胞功能下降，而Th2細(xì)胞功能相對升高，具體表現(xiàn)在Th1細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子減少，而Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子增多。Th1型細(xì)胞因子較Th2型細(xì)胞因子分泌增多稱為Th2/Th1型偏移，Th2型細(xì)胞因子較Th1型細(xì)胞因子分泌增多稱為Th1/Th2型偏移[6]，Th1/Th2型偏移，提示機(jī)體細(xì)胞免疫功能下降，免疫監(jiān)視功能降低，有利于腫瘤的生長;Th2/Th1型偏移，則細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)，具有有效的抑制腫瘤生長的效應(yīng)[7]。本實驗觀察到，熱環(huán)境下DEN誘發(fā)性的肝癌大鼠IL－2和IFN－γ分泌均減少，而IL－4、IL－10分泌則增多，發(fā)生了Th1/Th2型偏移，與模型組的變化一致;而寒環(huán)境組與正常對照組比較，僅IFN－γ分泌減少，但卻明顯高于熱環(huán)境下肝癌大鼠分泌量。這一結(jié)果提示，熱環(huán)境可能通過抑制T細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞，增加Th2型細(xì)胞，從而進(jìn)一步加重了DEN誘發(fā)性的肝癌大鼠免疫抑制狀態(tài)，而寒環(huán)境則似對上述病理過程有一定的改善作用，這可能是寒熱環(huán)境對DEN誘發(fā)性大鼠肝癌模型產(chǎn)生不同影響的機(jī)制之一。本文只是從肝癌模型大鼠的免疫因子受寒熱刺激影響的角度進(jìn)行了觀察，對于寒熱環(huán)境刺激對于正常大鼠免疫因子的影響本文未做研究，這可以作為進(jìn)一步研究的方向之一。

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