孫海梅 尚宏偉 張立新 季鳳清 周德山*

①首都醫(yī)科大學組胚教研室 北京 100069

脾臟是哺乳動物體內(nèi)最大的淋巴器官，富含血管和血竇等。雖為實質(zhì)性器官，但制作脾石蠟切片難度較大，每一個操作步驟均可影響最終的標本質(zhì)量。其中固定液的選擇尤為重要，直接影響最終的標本染色效果[1-2]。

1 材料與方法

1.1 儀器設備和主要試劑[3]

LEICA ASP 300自動脫水機。LEICA EG 1160自動包埋。LEICA RM 2235輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機。LEICA AUTO STAINER XL自動染色機。LEICA Q550IW圖像分析系統(tǒng)。主要試劑有中性福爾馬林固定液；Bouin固定液；Helly固定液；Ehrlich蘇木精；1%伊紅水溶液。

1.2 實驗動物

選用健康成年SD大鼠1只，雌雄不拘。

2 實驗方法

2.1 取材和固定

大鼠經(jīng)乙醚麻醉，剪斷頸總動脈放血處死，以減少脾內(nèi)多余的血液成分。為保持脾結(jié)構(gòu)的完整性，取材時應格外小心，盡量減少金屬器械觸碰脾實質(zhì)，用鑷子夾持脾周圍的結(jié)締組織，小心剝離剔除脾周圍多余組織，切取一塊近似等邊三角形組織塊，厚度為5～7 mm，迅速投入固定液中。選擇合適的固定液是制作良好脾標本的關(guān)鍵。對此嘗試以下常規(guī)固定液[3]：中性福爾馬林固定液，固定時間為24 h。Bouin固定液，固定時間為24 h。Helly固定液，固定12 h。

2.2 固定后處理

根據(jù)不同固定液的要求，采取不同的固定后處理。中性福爾馬林固定后流水沖洗12 h，蒸餾水洗。Bouin固定的組織直接使用70%乙醇，去除固定液中苦味酸的黃色。Helly固定的組織流水沖洗12 h，除去固定液中重鉻酸鉀后蒸餾水洗。

2.3 脫水和透明

用LEICA ASP 300自動脫水機將所有的固定后的組織常規(guī)脫水、透明。注意嚴格控制無水乙醇、二甲苯和浸蠟時間，防止組織變硬變脆影響切片效果。具體步驟：用70%乙醇、80%乙醇、 90%乙醇、95%乙醇脫水各3 h，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ脫水各2 h，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明各20 min，石蠟Ⅰ，石蠟Ⅱ浸蠟各40 min。

2.4 包埋和切片

用LEICA EG 1160自動包埋機進行石蠟包埋。脾臟是細胞密集的結(jié)構(gòu)，切片過厚將影響觀察效果。用LEICA RM 2235輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機切片，厚度為4μm，切片用烤箱50oC烘干。

2.5 HE染色和封片

用LEICA AUTO STAINER XL自動染色機進行HE染色。不同的固定液處理的組織切片在HE染色中，蘇木精和伊紅的染色及分色時間有所不同，染色中通過隨時鏡檢，優(yōu)化每一種固定液處理的組織切片的最佳的染色時間，獲得每種固定液處理的組織切片最佳染色標本。具體步驟如下。

⑴中性福爾馬林固定的組織切片：Ehrlich蘇木精染色15 min；鹽酸酒精溶液分色35 s；伊紅染色10 min；90%乙醇分色40 s。

⑵Bouin固定的組織切片：Ehrlich蘇木精染色20 min；鹽酸酒精溶液分色35 s；伊紅染色13 min；90%乙醇分色40 s。

⑶Helly固定的組織切片：Ehrlich蘇木精染色15 min；鹽酸酒精溶液分色35 s；伊紅染色10 min；90%乙醇分色40 s。

封片使用中性樹膠封固。

3 結(jié)果

用LEICA Q550IW圖像分析系統(tǒng)對3種不同的固定液處理的大鼠脾組織石蠟切片染色結(jié)果進行顯微鏡下觀察（染色結(jié)果見圖1、2、3），并從以下方面進行比較[4-5]，見表1。

圖1 大鼠脾石蠟切片HE染色標本中性福爾馬林固定×100

圖2 大鼠脾石蠟切片HE染色標本Bouin固定液固定×100

圖3 大鼠脾石蠟切片HE染色標本Helly固定液固定×100

表1 不同固定液對大鼠脾石蠟切片HE染色結(jié)果的比較

4 討論

組織固定的作用在于使蛋白變性、凝固、沉淀,保持細胞、組織原有的形態(tài)[6]。固定是制作脾石蠟切片標本的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，固定液中的化學成分的滲透力，PH值，滲透壓，固定時間等諸多因素影響固定液的固定效果[7]。所以選擇最佳的固定液將會直接影響標本的質(zhì)量和染色結(jié)果。經(jīng)三種不同的固定液處理的大鼠脾石蠟切片HE染色標本的染色效果各有不同，各有其優(yōu)缺點：中性福爾馬林固定液：是實驗室常規(guī)試劑[8]，配制簡單易行。但由于固定液中化學成分的滲透壓等原因造成結(jié)構(gòu)破損，使切片出現(xiàn)明顯的皸裂現(xiàn)象[9]；Bouin固定液：亦為實驗室常規(guī)固定液，配制簡單易行，此固定液是由甲醛、苦味酸和醋酸按一定比例混合而成, 苦味酸和醋酸配合使用能很好的保存組織結(jié)構(gòu)，因此固定的標本組織結(jié)構(gòu)完整。但染色不及其它兩種固定方法染色理想，細胞核與細胞質(zhì)對比強度不明顯[10]；Helly固定液：此固定液主要成分是氯化汞和重鉻酸鉀，甲醛等，氯化汞使組織硬化快，對細胞核和胞質(zhì)固定良好，并促進染色，重鉻酸鉀常用于混合固定液中，有助于組織染色[2]。所以經(jīng)此固定液固定的組織結(jié)構(gòu)完整，清晰，染色鮮艷，細胞核與細胞質(zhì)染色對比度好，為制作脾石蠟切片標本理想的固定液。但此固定液配制較復雜,且固定后需去除組織內(nèi)的重鉻酸鉀和“汞色素”，步驟較復雜。且此固定液中氯化汞屬于劇毒藥品，管理要嚴格，廢液需要妥善處理，避免環(huán)境污染。

5 結(jié)語

獲得理想的脾石蠟切片HE染色切片的方法：大鼠經(jīng)乙醚麻醉、頸總動脈放血，標本經(jīng)Helly固定液固定，常規(guī)脫水、透明、包埋，石蠟切片4μm，HE染色Ehrlich蘇木精染色15 min；鹽酸酒精溶液分色35 s；伊紅染色10 min；90%乙醇分色40 s，可獲得較理想的脾石蠟切片HE染色標本。

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